Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: P01CA040035 (FE / JAS) e VA Career Development Award (JAS).

1. Cella di manutenzione <ol><li> Subcloni ossa molti metastatici di MDA-MB-231 esistono che hanno propensione variabile per la colonizzazione e la crescita ossea. Per i nostri esperimenti usiamo un clone derivato dal GFP-etichettato MDA-MB-231 sviluppato UTHSCA 2. Questo particolare sub-clone formerà visibili lesioni osteolitiche a circa 3 dopo inoculazione settimane, con sacrificio a 4 settimane. </li><li> Mantenere le cellule in DMEM contenente 10% FBS e 0,1 mg / ml di penicillina-streptomicina a 37 ° C nel 5-8% CO 2 7. </li><li> Cellule passaggio a 80-90% di confluenza e ri-piastra ad una diluizione 1:10 (questo varia a seconda del tipo di cellula e la piastra di dimensioni. Per MDA-MB-231 cellule in un T-75 è di circa 6x10 5), che è circa ogni 72 ore. </li><li> MDA-MB-231 cellule di mantenere un aspetto generalmente fibroblastica con numerosi pseudopodi. Ogni arrotondamento è indicativo di sovraffollamento o altre sollecitazioni indesiderabili, e dovrebbe essere evitata poiché questopossono influenzare il potenziale metastatico in vivo. </li><li> Idealmente, le celle devono essere mantenute in coltura solo brevemente prima dell&#39;inoculazione (si consiglia di meno di 1 sett o fino a quando si dispone di celle sufficiente per l&#39;esperimento), e un nuovo flaconcino devono essere scongelati se arrotondamento o modifiche del tasso di crescita delle cellule si verificano. </li></ol> 2. Preparazione cellulare <ol><li> Tripsinizzare le cellule a 80-90% di confluenza con 0,15% di tripsina / EDTA (diluire 0,5% Gibco tripsina EDTA 1:2 in PBS). Questa concentrazione permette il distacco rapido (&lt;2 min) e riduce aggregazione delle cellule. </li><li> Immediatamente rimuovere le cellule dalla piastra con 10 ml ghiacciata DMEM contenente 10% FBS, pipetta in 15 ml tubo conico e centrifugare a 200 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet in una provetta da 50 ml in 25 ml di PBS ghiacciato (senza Ca e Mg) e contare. </li><li> Centrifugare nuovamente pellet e risospendere a 10 6 cellule per ml (intracardiaco) o in 250.000 cells/10 pl (intratibial) in PBS ghiacciato. La temperatura di PBS è importante per evitare grumi di cellule ed embolia successiva dopo l&#39;iniezione. La sospensione cellulare dovrebbe rimanere in ghiaccio durante l&#39;esecuzione di iniezioni e sarà vitale e rimangono non-aggregata per 30 min. Mentre il numero esatto di tavole che sono necessarie varia da ricercatore a ricercatore, generalmente usiamo 1 T-75 per 8-10 topi. </li></ol> 3. Inoculazione intracardiaca <ol><li> 4-6 femmina settimana fa (Foxn nu-/ -: Harlan) topi sono usati per questi esperimenti, sebbene altri topi immunodeficienti (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, e così via) possono anche essere usati negli esperimenti di cellule umane di cancro. </li><li> I topi nudi devono essere alimentati Teklad giorni di dieta 2920x 5-10 prima dell&#39;iniezione per ridurre la mortalità per la procedura di iniezione, e ridurre la fluorescenza di fondo nelle procedure di imaging (in quanto il cibo è gratuito erba medica). </li><li> In caso di utilizzo di altri topi nu / nu, rimuovere i capelli con la rasatura o con Nair (nel nostro Nair esperienza funziona meglio) sulla ventrale addominale area prima di iniziare procedura. </li><li> Anestetizzare mouse in una camera di isolamento utilizzando un vaporizzatore isoflurano (2,5% Iso: 2-3 L / min O 2) o di altra anestesia preferito (nella nostra esperienza isoflurano è la migliore tollerata per vaccinazioni intracardiaci). </li><li> Muovere un mouse alla volta per il cono della macchina per anestesia all&#39;interno di una cappa in acciaio inox ventilato. </li><li> Posizionare ogni mouse sulla schiena con petto rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Lavare il petto con un 10% di povidone / iodio tampone / soluzione seguito da etanolo al 70%, ripetere 2 volte. </li><li> Torace Mark mouse per iniezione (con un pennarello sterile o marcatura leggermente di lato per mantenere il sito di iniezione sterile). Usiamo una posizione a metà strada tra il marchio sternale ed ultimo piano di processo xifoideo, e un po &#39;a sinistra (anatomica) dello sterno. Disegnare una piccola bolla d&#39;aria nella siringa per creare spazio tra il pistone e il menisco (importante per vedere impulso cardiaco) di un pl 300 28 g ½ siringa da insulina, eelaborare 100 pl di cellule. </li><li> Tenere l&#39;ago in posizione verticale. Mentre si tiene la pelle tesa del mouse con l&#39;altra mano, inserire l&#39;ago. </li><li> Inserimento di successo nel ventricolo sinistro cardiaco dovrebbe sfociare in un distinto impulso luminoso rosso del sangue nella siringa. A questa profondità, con attenzione abbassare stantuffo della siringa (100 microlitri di volume), senza movimento significativo dell&#39;ago per evitare la puntura del cuore o le celle che si rovesciano nella cavità toracica. </li><li> Dopo cellule vengono iniettate, sollevare leggermente il pistone per creare una piccola quantità di pressione negativa per ridurre gocciolamento di cellule nella cavità toracica. </li><li> Estrarre l&#39;ago direttamente dal petto pur essendo sicuri di evitare di inclinare l&#39;ago durante la rimozione, che può strappare il rivestimento del cuore e causare sanguinamento. </li><li> Applicare una leggera pressione al petto sul sito di iniezione per ridurre il sanguinamento. </li><li> Rimuovere il mouse dal cono naso e continuano ad esercitare una leggera pressione per circa 1 min. </li><li> Muovi il mouse per rilievo di riscaldamento fino a completo concosciente. </li><li> Se il mouse inizia a girare o contrarsi dopo il recupero, la causa più probabile è un embolia. Iniettare topo intraperitonally con 80-120 mg / kg di ketamina per aumentare il flusso sanguigno e la gittata cardiaca, diminuendo la resistenza vascolare. Questo dovrebbe aiutare il mouse passare il coagulo. Quando questo si verifica, è meglio cambiare preparazioni di cellule, in quanto indica che le cellule sono grumi. Cambiamo preparazioni di cellule dopo circa 8 topi, o 30 min. </li></ol> 4. Intratibial <ol><li> Iniettare mouse con Buprenex (0,1 mg / kg) o simili analgesico approvato immediatamente prima procedura. </li><li> Anestetizzare il mouse utilizzando isoflurano, poi passare a cono e mantenere l&#39;anestesia. </li><li> Pulire entrambe le gambe con il 10% di povidone / iodio tampone / soluzione, seguito da etanolo, ripetendo 2 volte. Gambe depilate (con Nair o prodotto analogo) prima della pulizia se presente pelliccia. </li><li> Afferrare con delicatezza malleolo laterale, malleolo mediale, e la metà inferiore della tibia e con l&#39;indice °UMB, quindi gamba curva (combinazione di flessione e rotazione laterale, in modo tale che il ginocchio è visibile e accessibile. </li><li> Inumidire la pelle con il 70% EtOH per aumentare la visibilità del sottostante legamento patellare, che dovrebbe essere visibile come una distinta, spesso, linea bianca. Mentre impugnando saldamente caviglia / gamba di inserto del mouse 28g ½ ago sotto rotula, attraverso il centro del legamento rotuleo, e nella zona intercondiloidea anteriore nella parte superiore della tibia. </li><li> Quando si inserisce l&#39;ago nella tibia, guidare con attenzione attraverso la piastra con una crescita costante, pressione costante con l&#39;azione di perforazione leggero. </li><li> Dopo la penetrazione di cartilagine di accrescimento tibiale, l&#39;ago incontrerà una resistenza nettamente inferiore. </li><li> Utilizzare un dolce, movimento laterale dell&#39;ago per garantire ago si trova nella tibia e attraverso la cartilagine di accrescimento. Il movimento è limitato, se l&#39;ago è in posizione corretta all&#39;interno della tibia. </li><li> Premere lentamente lo stantuffo per iniettare 10 ml di soluzione cellulare. Poca o nessuna resistenza deve essere sentito a questo punto. </li><li> Slowly estrarre l&#39;ago. </li><li> Seguendo la stessa procedura, passare al successivo tratto di iniettare 10 ml di PBS. </li><li> Rimuovere il mouse dall&#39;anestesia e continuare a rilievo di riscaldamento fino al recupero. </li><li> Monitorare i topi per i prossimi 24 ore e iniettare con Buprenex aggiuntiva ogni 12 ore se gli animali continuano a mostrare segni di sofferenza. </li></ol> 5. Imaging tempo <ol><li> Imaging Luciferase: Se del caso, l&#39;imaging luciferasi dovrebbe essere utilizzato a partire a 7 giorni dopo l&#39;inoculazione delle cellule tumorali (anche se nella maggior parte dei modelli metastasi ossee, rilevabile più vicino al giorno 14). Mouse viene iniettata per via intraperitoneale con 150 mg / kg luciferina, anestetizzati, e ripreso 8 min dopo l&#39;iniezione utilizzando attrezzature IVIS 8. </li><li> GFP immagini: in genere i tumori che esprimono GFP-cominciano ad essere rilevabili intorno al giorno 10-14 per preparazioni iniettabili intratibial e 16-21 per gli esperimenti che utilizzano intracardiaci Maestro immagini oggetto (CRI) 9. In breve, i topi vengono anestetizzati con isoflurano (3%) E mantenuti sotto anestesia mediante un cono nella camera Maestro imaging. Per i nostri eGFP-cellule che esprimono usiamo un set di filtro blu (498 excitation/515 emissione per eGFP) a 500 ms di esposizione a passi di 10 nm. </li><li> Faxitron (X-ray): I raggi X sono presi a settimana a partire tra il giorno 7 a 14. Le lesioni saranno visibili nel modello intracardiaca al giorno 21 e una settimana prima del intratibial iniezioni 3. I nostri dati radiografici per ex vivo e in vivo è stato acquisito con un Faxitron LX-60 a 35 kV per 8 secondi di esposizione. </li><li> Altre immagini: modalità di imaging sarà interamente basato sulla ricerca specifica. Oltre ai metodi di cui sopra, l&#39;imaging animale vivo sulla base di 3D micro-tomografia computerizzata (μCT), micro-tomografia ad emissione di positroni (μPET), e altre modalità 10,11 in grado di fornire preziose informazioni. </li></ol> 6. Mouse Sacrificio <ol><li> Ogni modello ha un decorso leggermente diverso. Con MDA-MB-231 topi cellule di solito diventano cachettico o paraplegico tra 21 e 35 giorni e solitamente intorno 28 ° giorno (IT iniettato nei topi tra 21-28 giorni). </li><li> Una volta che i topi più sviluppare lesioni che iniziano a rompere l&#39;osso corticale, diventato paraplegico, o si perde tra il 10-20% del peso corporeo, sacrificare tutti i topi in studio con ketamina / xilazina sovradosaggio con dislocazione cervicale (o altro metodo IACUC approvato). </li><li> Togliere le ossa necessari per ulteriori studi e conservare in formalina tamponata al 4%. </li><li> I topi con tumori del torace sono il segno di una iniezione di mancato e dovrebbero essere esclusi dallo studio. </li></ol> 7. Ex Vivo Analisi <ol><li> μCT: scansione in 70% EtOH consente ai parametri strutturali e istologici da misurare sul provino stesso osso. </li><li> Contour e analizzare secondo singolo disegno sperimentale e le attrezzature disponibili 10. I nostri dati sono stati ottenuti con un μCT Scanco 40 con risoluzione di 12 uM. </li><li> Histomorphometry: i campioni di processo con metodi istologici preferite e colorare con ematossilina / eosina 7 </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Seguito di inoculazione intracardiaca o intratibial di cellule tumorali (Figura 1) topi sono monitorati settimanalmente dalla radiografia e fluorescenza (o luminescenza). Lesioni normalmente risulteranno da x-ray settimana tra 2 e 3, mentre possono essere visibili da fluorescenza e luminescenza già alla settimana 2, a seconda del modello (Figura 2). Le lesioni sono visibili come fori scuri nell&#39;osso, e diventano più pronunciati con il tempo (Figura 3). Le lesioni sono stati quantificati utilizzando l&#39;analisi Metamorph delle radiografie e la fluorescenza è stata quantificata utilizzando Maestro (CRI) di acquisizione immagini e software di analisi. Per quanto le lesioni cominciano a crescere, i topi diventano spesso cachettico. Il sacrificio è richiesto quando i topi hanno perso tra il 10-20% del loro peso corporeo iniziale. La condizione del<html> topi possono cambiare rapidamente e deve essere monitorato più volte durante la giornata. Tra 3-4 settimane i topi cominciarono a trascinare uno o entrambi gli arti posteriori e l&#39;intero studio è stato sacrificato. Le immagini sono state prese prima del sacrificio. Dopo l&#39;overdose di anestesia, il sangue è stato raccolto per misurare i marcatori del turnover osseo o da altri fattori. Dopo dislocazione cervicale, la pelle è stata spogliata dal mouse e ossa asportato e pulito per ex vivo imaging (Figura 3) che permette la visualizzazione di foci tumorali almeno 7 giorni di anticipo rispetto a tecniche di imaging in vivo. Una volta che le ossa di imaging è stato completato sono stati posti in cassette etichettati e conservati in formalina per la fissazione e l&#39;ulteriore elaborazione o analisi istologica μCT. Istomorfometria stata effettuata su campioni per indicare il carico tumorale e BV / TV dopo μCT è stata eseguita su una tibia di quantificare la quantità di distruzione ossea (Figura 4). / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Corretto posizionamento di iniezione. Ventrale vista radiografico (A) del torace topo adulto mostrando corretto posizionamento dell&#39;ago nello spazio intercostale 4 ° e nel ventricolo sinistro per inoculazione intracardiaca. Punti di riferimento anatomici sono rappresentati con linee orizzontali tratteggiate sullo sterno (evidenziato in bianco). Sulla pelle del topo e del sternale processo xifoideo servono come punti di riferimento, e l&#39;ago viene inserito leggermente a sinistra dello sterno. Vista radiografico ventrale (B) della gamba topo adulto mostrando corretto posizionamento dell&#39;ago nella tibia prossimale, allineati tra i condili. Da un punto di vista laterale la punta dell&#39;ago è posto dietro la tuberosità tibiale e profondo alla piastra epifisaria. Posizione ideale per l&#39;iniezione è dimostrato dal cerchio bianco. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> Figura 2. Naturalmente il tempo di modelli di metastasi ossee. Progressione di cancer indotta da malattia ossea mostrato con i raggi X e la GFP + immagini fluorescenti dei tumori in vivo da intratibial iniezioni (A) e intracardiaca iniezioni (B). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> Figura 3. Naturalmente il tempo di intracardiaca MDA-MB-231 modello Top Row:. Immagine ex vivo che mostra fluorescenza GFP, al giorno 0, 14, 21, e 28 dopo l&#39;iniezione intracardiaca di MDA-MB-231. Notare che focolai tumorali al giorno 14 sono visibili solo in ex vivo dopo la rimozione del tessuto molle. Riga in basso: le immagini radiografiche ex vivo dei femori stessi illustrano lesioni ossee osteolitiche. Si noti che la distruzione ossea di solito non è visibile fino a 3 settimane dopo l&#39;iniezione cardiaco. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificazione della progressione metastatica ossea. GFP + tumore come visualizzato dal Maestro immagini ex vivo di Tibiae di un non-tumore topo cuscinetto (A) e un mouse 4 settimane dopo l&#39;iniezione intracardiaca di una GFP esprimere MDA-MB-231 subclone (B). Foci tumorali correlate con aree di distruzione ossea come mostrato da Faxitron (D) contro un osso senza tumore (C). Dati strutturali e minerale osseo di misurazioni microCT viene reso come immagini 3d di un osso sano (E) e un osso cuscinetto tumore (F) in cui aree di distruzione ossea sono mostrati come zona vuoto. Ulteriori dettagli delle ossa e del tumore è visto in corrispondenti H &amp; E sezioni colorate istologiche (G &amp; H).

<ol>
	<li>Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+biology+of+bone+metastasis:+how+the+skeleton+affects+tumor+behavior.">Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior.</a> Bone. 48, 6-15 (2011).</li><li>Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteolytic+bone+metastasis+in+breast+cancer.">Osteolytic bone metastasis in breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 32, 73-84 (1994).</li><li>Johnson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+promotion+of+Gli2-induced+expression+of+parathyroid+hormone-related+protein,+an+important+osteolytic+factor+in+bone+metastasis,+is+independent+of+canonical+Hedgehog+signaling.">TGF-beta promotion of Gli2-induced expression of parathyroid hormone-related protein, an important osteolytic factor in bone metastasis, is independent of canonical Hedgehog signaling.</a> Cancer Res. 71, 822-831 (2011).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TGF-beta+Responsiveness+in+Prostate+Stromal+Cells+Alters+Chemokine+Levels+and+Facilitates+the+Development+of+Mixed+Osteoblastic/Osteolytic+Bone+Lesions.">Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lesions.</a> Mol. Cancer Res. , (2012).</li><li>Yoneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+bisphosphonate+on+bone+metastasis+in+animal+models+of+breast+carcinoma.">Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma.</a> Cancer. 88, 2979-2988 (2000).</li><li>Rose, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone.">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).</li><li>Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hedgehog+signaling+molecule+Gli2+induces+parathyroid+hormone-related+peptide+expression+and+osteolysis+in+metastatic+human+breast+cancer+cells.">The hedgehog signaling molecule Gli2 induces parathyroid hormone-related peptide expression and osteolysis in metastatic human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 66, 7548-7553 (2006).</li><li>Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+alpha4beta1-positive+osteoclast+progenitors.">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20, 701-714 (2011).</li><li>Oyajobi, B. 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Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease.">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Studi di tumore-indotta malattia ossea contare su diversi modelli animali di cui i due più comunemente utilizzati sono inoculazioni intracardiaci e intratibial. In molti casi intracardiaca è l&#39;opzione migliore per lo studio di metastasi alle ossa, tuttavia, non rappresenta l&#39;intero processo metastatico e quindi cuscinetto adiposo mammario o altre iniezioni ortotopici dovrebbero idealmente essere utilizzati verso quella fine. Le cellule tumorali non metastatizzare rapidamente dal sito primario nella maggior par...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 cellule umane di cancro al seno </td><td> Originariamente ATCC-Internamente clonato e selezionato </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech Inc </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlas biologica </td><td> F-0050a </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td> Maestro </td><td> CRi </td><td></td></tr><tr><td> μCT scanner </td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td> Topi nudi atimici </td><td> Harlan </td><td> Fox nu - / - </td></tr><tr><td> Siringhe da insulina (300 ml, 28,5 g) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td> Pinza </td><td></td></tr><tr><td> Roditori dieta irradiata </td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

models of bone metastasis

Le metastasi ossee sono un evento comune in tumori maligni, tra cui mammella, della prostata e del polmone. Una volta stabilito in osso, i tumori sono responsabili di morbilità e mortalità significative 1. Quindi, vi è una grande necessità di comprendere i meccanismi molecolari che controllano la crescita, creazione e l&#39;attività di tumori in osso. Diversi modelli in vivo sono stati istituiti per studiare questi eventi e ognuno ha vantaggi e limiti specifici. Il modello più comunemente usato utilizza inoculazione intracardiaca delle cellule tumorali direttamente nella fornitura di sangue arterioso atimici (nudo) topi BalbC. Questo procedimento può essere applicato a molti diversi tipi di tumore (inclusi PC-3 cancro alla prostata, carcinoma del polmone, e topo tumori mammari cuscinetto di grasso), tuttavia, in questo manoscritto ci concentreremo sul modello di cancro al seno, MDA-MB-231. In questo modello ci avvaliamo di un clone molto osso-selettivo, originariamente derivato nel gruppo Dr. Mundy a San Antonio 2, che hda allora è stato transfettate per l&#39;espressione GFP e ri-clonato dal nostro gruppo 3. Questo clone è una variante osseo metastatico con un alto tasso di osteotropism e metastasi poco da polmone, fegato, o ghiandole surrenali. Mentre iniezioni intracardiaci sono più comunemente utilizzati per gli studi di metastasi ossee 2, in alcuni casi, intratibial 4 o mammaria iniezioni di cuscinetto adiposo sono più appropriati. Iniezioni intracardiaci sono tipicamente eseguite utilizzando cellule tumorali umane con l&#39;obiettivo di monitorare le fasi successive di metastasi, in particolare la capacità delle cellule tumorali di arrestare in osso, sopravvivere, proliferare, e stabilire tumori che si sviluppano in tumore-indotta malattia ossea. Intratibial iniezioni vengono eseguite se concentrandosi sul rapporto delle cellule tumorali e ossee dopo un tumore ha metastatizzato alle ossa, che è correlato o meno una costante malattia metastatica ossea. Nessuno di questi modelli ricapitola primi passi nel processo metastatico prima di embolia e l&#39;ingressodi cellule tumorali nella circolazione. Se monitorare la crescita del tumore primario o metastasi dal sito primario alle ossa, poi mammarie vaccinazioni cuscinetto adiposo sono in genere preferito, tuttavia, pochissimi linee cellulari tumorali in modo coerente metastasi alle ossa dal sito primario, con 4T1 osso preferenziali cloni, un mouse mammaria carcinoma, essendo l&#39;eccezione 5,6. Questa procedura dettagli inoculazione manoscritti e le fasi principali evidenzia nelle analisi post-inoculazione. In particolare, include colture cellulari, cellule tumorali procedure di inoculazione di vaccini intracardiaci e intratibial, così come brevi informazioni riguardo monitoraggio settimanale di raggi X, fluorescenza e analisi istomorfometrici.

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Models of Bone Metastasis

I modelli animali sono spesso utilizzati per studiare metastasi alle ossa. In questo protocollo si descrivono due metodi comuni di inoculo del tumore per gli studi di metastasi ossee e descrivere brevemente alcune delle analisi utilizzati per monitorare e quantificare questi modelli.

Modelli di metastasi ossee

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Research

JoVE Journal

Medicine

41.9K Views.  Vanderbilt University. I modelli animali sono spesso utilizzati per studiare metastasi alle ossa. In questo protocollo si descrivono due metodi comuni di inoculo del tumore per gli studi di metastasi ossee e descrivere brevemente alcune delle analisi utilizzati per monitorare e quantificare questi modelli.

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Metastasi di analisi sperimentale

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Ricerca

Medicina

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Adjustable Stiffness, External Fixator for the Rat Femur Osteotomy and Segmental Bone Defect Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there has been great clinical interest in improving bone healing by altering the mechanical environment through the fixation stability around the lesion. One constraint of preclinical animal research in this area is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a large segmental defect as well as osteotomies as they heal. In this paper we report on the design and use of an external fixator to study the healing of large segmental bone defects or osteotomies. This device not only allows for controlled axial stiffness on the bone lesion as it heals, but it also enables the change of stiffness during the healing process in vivo. The conducted experiments have shown that the fixators were able to maintain a 5 mm femoral defect gap in rats in vivo during unrestricted cage activity for at least 8 weeks. Likewise, we observed no distortion or infections, including pin infections during the entire healing period. These results demonstrate that our newly developed external fixator was able to achieve reproducible and standardized stabilization, and the alteration of the mechanical environment of in vivo rat large bone defects and various size osteotomies. This confirms that the external fixation device is well suited for preclinical research investigations using a rat model in the field of bone regeneration and repair.

One constraint of preclinical research in the field of bone repair is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a healing bone lesion. We report the design and use of an external fixator for bone repair with the ability to change fixator stiffness in vivo.

Rigidità regolabile, fissatore esterno per le Rat Femore osteotomia e segmentale Bone Difetto Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Ad alta frequenza di Ecografia del mouse cervicali Linfonodi

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

A &quot;paziente-Like&quot; ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...