Gli organoidi derivati dal paziente umano sono sistemi modello tridimensionali in vitro che rappresentano sia la diversità del paziente che l'eterogeneità cellulare dei tumori. Questo protocollo e la dimostrazione video forniscono una guida dettagliata e pratica per stabilire il tumore al seno derivato dal paziente e gli organoidi normali. Gli organoidi del tumore al seno derivati dal paziente sono nuovi modelli entusiasmanti, ma difficili da stabilire.
Il protocollo completo che forniamo qui dovrebbe aiutare a preparare i ricercatori che tentano di sviluppare organoidi mammari e familiarizzare con le sfide previste. Ogni linea DOP derivata da un paziente diverso è unica per morfologia e tasso di crescita. A differenza di due sistemi di linee cellulari 2D, gli organoidi crescono meglio se placcati ad alta densità, consentendo migliori interazioni intercellulari.
A dimostrare la procedura sarà Disha Aggarwal, uno studente laureato nel mio laboratorio. Per iniziare, scongelare una bottiglia di matrice di membrana basale sul ghiaccio o durante la notte a quattro gradi Celsius. Trasferire il tessuto resecato in una capsula di Petri sterile di 10 centimetri.
Esaminare il tessuto macroscopicamente e prendere nota se appare morfologicamente grasso, vascolarizzato o necrotico. Inoltre, registra le dimensioni e la forma del tessuto e scatta una foto del tessuto con un righello in vista. Tritare il tessuto in piccoli pezzi con un bisturi sterile numero 10 e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri.
Aggiungere 10 millilitri di due milligrammi per millilitro di soluzione di collagenasi IV e sigillare il tubo. Posizionare il tubo su uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius a 140 RPM per 30-90 minuti con un angolo di 30 gradi. Durante l'incubazione, posizionare un'aliquota di mezzo completo per preriscaldare a 37 gradi Celsius in una perlina o a bagnomaria.
Ogni 15 minuti, risospendere il tessuto mescolando su e giù vigorosamente usando una pipetta sierologica da cinque millilitri, sterile, pre-rivestita. Dissociazione monitorata nel tempo osservando il tubo al microscopio con un ingrandimento 5X o superiore. Una volta dissociato il tessuto, centrifugare a 400 G per cinque minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di AdDF+Again, centrifugare e aspirare con cura il surnatante, poiché i pellet di tessuto possono occasionalmente essere sciolti.
Se il pellet di tessuto è parzialmente rosso, aggiungere due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di AdDF+ al tubo, centrifugare a 400 G per cinque minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 50-300 microlitri di matrice di membrana basale fredda non diluita e miscelata mediante pipettaggio con attenzione per evitare la formazione di bolle.
Utilizzando una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti che viene preriscaldata nell'incubatore durante la notte, piastra 300 microlitri di cupola a matrice di membrana basale contenente organoidi in ciascun pozzetto. Lasciare la piastra indisturbata nel cappuccio per cinque minuti prima di posizionarla a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti affinché la cupola della matrice della membrana basale si solidifichi completamente. Alla fine dell'incubazione, aggiungere tre millilitri di mezzo completo preriscaldato a goccia a goccia a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Dopo l'incubazione, catturare immagini degli organoidi utilizzando un obiettivo 5X su un microscopio a campo luminoso invertito. Sollevare la cupola della matrice della membrana basale nel mezzo nel pozzetto utilizzando un raschietto cellulare o una punta per pipetta da un millilitro. Utilizzando una punta per pipetta preverniciata, trasferire la cupola galleggiante degli organoidi con mezzo a un tubo conico da 15 o 50 millilitri, a seconda del numero di pozzetti raccolti.
Quindi aggiungere DPBS per aumentare il volume ad almeno cinque millilitri. Girare i tubi a 400 G per cinque minuti. La matrice della membrana basale con organoidi forma uno strato nella parte inferiore.
Dopo aver aspirato il surnatante, aggiungere da 5 a 20 millilitri di DPBS, a seconda del numero di pozzetti raggruppati in un tubo. Miscelare il pellet della matrice della membrana basale organoide in DBPS utilizzando una pipetta monouso sterile preverniciata. Ancora una volta, centrifugare e scartare il surnatante.
Utilizzando una punta di pipetta rivestita, aggiungere il reagente di dissociazione cellulare a tre volte il volume della matrice della membrana basale e risospendere gli organoidi. Posizionare il tubo su uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius a 140 RPM per 8-15 minuti in posizione angolata. Monitorare il tubo osservandolo al microscopio ogni cinque minuti per assicurarsi che gli organoidi siano suddivisi in gruppi più piccoli.
Aggiungere AdDF+ ad un volume uguale o superiore al reagente di dissociazione cellulare e pipetta per miscelare gli organoidi. Girare a 400 g per cinque minuti per ottenere un pellet organoide. Una volta ottenuto un pellet organoide bianco senza matrice di membrana basale non disciolta, scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di AdDF + Portare il volume a 10 millilitri con AdDF + Spin il tubo per la fase di lavaggio e scartare il surnatante.
Aggiungere la quantità necessaria di matrice di membrana basale agli organoidi digeriti in base al rapporto di divisione appropriato. Mescolare con pipettaggio delicato su e giù per evitare di creare bolle e posizionare immediatamente sul ghiaccio. Cupole di organoidi da 300 microlitri risospese in una matrice di membrana basale in una piastra a sei pozzetti preriscaldata.
Lasciare la piastra indisturbata nel cofano per cinque minuti prima di posizionarla a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 20-30 minuti affinché le cupole si solidifichino. Alla fine dell'incubazione e tre millilitri di mezzo completo preriscaldato a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra nell'incubatore. Aggiungi un mezzo completo fresco ogni cinque-sette giorni.
Le varie linee organoidi di tumore al seno derivate da pazienti differiscono per morfologia e tasso di crescita. Gli organoidi mammari normali e i pochi carcinomi duttali precoci negli organoidi derivati da C2 assomigliavano alla normale struttura mammaria, con un lume centrale circondato da cellule duttali. Gli organoidi derivati dal carcinoma lobulare invasivo tendono a formare strutture simili a grappoli d'uva vagamente attaccate.
Nel frattempo, gli organoidi derivati da carcinomi duttali invasivi tendono a formare organoidi densi, grandi e rotondi. La crescita degli organoidi è stata misurata utilizzando un saggio di vitalità cellulare luminescente nei giorni tre, sei, nove e 12, con una lettura basale il primo giorno dopo la placcatura. Le immagini a campo chiaro degli stessi organoidi espansi nel tempo sono mostrate qui.
Alcune linee organoidi derivate dal paziente hanno un tempo di raddoppio di due giorni, mentre alcune richiedono cinque giorni. È importante essere pazienti con particolari linee organoidi che sono lente da stabilire. Nella nostra esperienza, l'aumento della densità di placcatura o il filtraggio dei detriti promuove la crescita delle DOP.
Gli organoidi derivati dal paziente, o PDO, sono modelli eccellenti per lo screening dei farmaci. Essi modellano le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare che sono fondamentali per studiare la fisiopatologia del cancro. Inoltre, le DOP possono subire manipolazioni genetiche e possono essere utilizzate per sviluppare xenotrapianti in sistemi di co-coltura, rendendoli ottimi modelli per studi meccanicistici.
