I modelli organoidi guidati dal paziente rappresentano geneticamente e funzionalmente i loro tumori genitori e quindi sono modelli affidabili per lo studio di nuove terapie e processi biologici complessi nel cancro ovarico. Ricapitolando l'eterogeneità clonale, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula in vitro, questi modelli superano i limiti delle linee cellulari tumorali e degli xenotrapianti derivati dai pazienti. Gli organoidi derivati dal paziente offrono capacità di espansione e stoccaggio a lungo termine e imitano la fisiologia del tumore.
Di conseguenza, sono modelli ideali per lo studio di nuove terapie e biomarcatori predittivi. Iniziare la raccolta degli organoidi posizionando i campioni tumorali in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri e tritando il tessuto per creare una miscela omogenea usando un bisturi usa e getta. Posizionare la miscela di tessuto omogeneo in un tubo di dissociazione usando una pinza.
Per ogni uno o due millilitri di tessuto omogeneizzato aggiungere da sette a otto millilitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di collagenasi di tipo due in mezzo base organoide e un millilitro di soluzione DNase One. Vortice la soluzione a 458 G.Liquefare il tessuto mentre è nella soluzione di collagenasi usando la macchina di dissociazione. Eseguire il programma 37 C underscore H underscore TDK tre un'ora fino a quando non è una sospensione a cella singola.
Una volta fatto, trasferire la miscela omogeneizzata in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere da 20 a 40 millilitri di terreno base organoide e vortice la soluzione a 458 G.Quindi filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri appena etichettato. Quindi, centrifugare la miscela filtrata a 1.650 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante usando una pipetta di pascolo di vetro.
Preparare 100 microgrammi per millilitro di Dnase One e risospendere le cellule in un millilitro di soluzione di Dnase One aggiungendo una soluzione di DNase One a goccia. Dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente aggiungere 25 millilitri di mezzo base organoide alle cellule e invertire per mescolare. Quindi centrifugare le cellule a 1.650 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare accuratamente il surnatante usando una pipetta di pascolo di vetro.
Risospendere il pellet cellulare appena formato in cinque millilitri di globuli rossi preriscaldati o tampone di lisi RBC. Vortice le soluzioni in ciascun tubo conico a 458 G e incubare per cinque minuti. Anche in questo caso, centrifugare il pellet sospeso in tampone di lisi RBC e aspirare il surnatante usando una pipetta da pascolo di vetro.
Lavare il pellet con 10 millilitri di PBS e vortice le celle prima della centrifugazione delle cellule. Per un pellet a celle grandi, aspirare il PBS e aggiungere un millilitro del mezzo base organoide sopra il pellet. Dopo aver vorticolato la soluzione, trasferire da 300 a 400 microlitri della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga.
Dopo cinque minuti di centrifugazione, aspirare il surnatante e risospenderlo nell'estratto di membrana basale, o BME, e nel mezzo base organoide utilizzando punte fredde. Placcare la soluzione cellulare risospesa in una piastra a sei pozzetti in aliquote da 40 microlitri. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto.
Posizionare immediatamente la piastra del pozzetto nell'incubatore per 20 minuti e, dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente due millilitri del mezzo organoide completo in ciascun pozzetto. Aggiungere un millilitro di terreno base organoide a ciascun pozzetto e pipettare il mezzo su e giù direttamente sulle linguette organoidi per la dissociazione. Raccogliere tutto il mezzo contenente il pellet risospeso in un tubo conico da 15 millilitri.
Quindi, centrifugare il tubo conico da 15 millilitri contenente la miscela per cinque minuti prima di aspirare il surnatante. Aggiungere un millilitro di enzima ricombinante libero di origine animale al pellet cellulare. Mescolare a vortice e trasferire la sospensione in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Dopo 15 minuti di incubazione in bagnomaria a 37 gradi Celsius e cinque minuti di centrifugazione, aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in BME e mezzo base organoide e placcare la soluzione cellulare risospesa in una piastra a sei pozzetti in aliquote da 40 microlitri. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto.
Dopo 20 minuti di incubazione, aggiungere delicatamente due millilitri del mezzo organoide completo in ciascun pozzetto. Risospendere il pellet di cellule organoidi di passaggio in 0,5-un millilitro di terreno di congelamento della coltura cellulare di recupero e trasferire un millilitro in ciascuna fiala di criofila prima di trasferirli a meno 80 gradi e serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Scongelare gli organoidi trasferendo le fiale criogeniche conservate in azoto liquido a 37 gradi Celsius a bagnomaria.
Una volta scongelati, trasferire gli organoidi in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugarli prima di aspirare il surnatante. Quindi, aggiungere un millilitro di PBS al pellet e trasferire il pellet risospeso in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri Dopo la centrifugazione a 1.650 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta di pascolo di vetro. Risospendere il pellet in BME e mezzo base organoide e placcare le celle risospese su una piastra a sei pozzetti in aliquote da 40 microlitri.
Posizionare fino a cinque aliquote per pozzetto. Posizionare immediatamente la piastra nell'incubatore per 20 minuti prima di aggiungere due millilitri di mezzo organoide completo ai pozzetti. Gli organoidi sono stati stabiliti in 10 giorni dopo di che hanno dimostrato organoidi discreti in coltura.
Le colture organoidi derivate dai pazienti sono state valutate incorporandole nell'agarosio e valutandole con colorazione con ematossilina ed eosina. È importante considerare le sfide di lavorare con BME. La risospensione del pellet cellulare e del BME deve essere effettuata su ghiaccio assicurandosi che non si formino bolle nel processo.
Questa tecnica consente ulteriori ricerche sull'impatto della chemioterapia sulla generazione e lo sviluppo di organoidi a causa dei problemi incontrati dai pazienti sottoposti a chemioterapia neoadiuvante.
