Questo metodo consente ai ricercatori di determinare le condizioni ottimali di pulsazione dell'elettroporazione per il tipo di cellula desiderato, riducendo al minimo la necessità del tradizionale approccio sperimentale empirico. Questo metodo utilizza tecniche di micro-elettroporazione per produrre un dispositivo di attuazione microfluidica scalabile in grado di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare durante tutto il processo di elettroporazione. A dimostrare la procedura sarà Kishankumar Busha, uno studente di master del mio laboratorio.
Per iniziare, fissare il wafer di silicio al mandrino del rivestimento di centrifuga del wafer utilizzando il sistema di vuoto del rivestimento di centrifuga. Quindi programmare lo spinner. Quindi, erogare quattro millilitri di SU-8 2010 photo resist sul centro del wafer di silicio ed eseguire il programma.
Una volta che il sistema si arresta, spegnere l'aspirapolvere. Quindi fissare la maschera fotografica con i disegni del canale microfluidico 2D sul supporto della maschera e inserire il wafer di silicio con il rivestimento SU-8 rivolto verso l'alto sul mandrino del wafer. Impostare le impostazioni di esposizione per 150 millijoule per centimetro quadrato ed eseguire la macchina.
Dopo l'esposizione ai raggi UV, immergere il wafer di silicio nella soluzione di sviluppo SU-8 agitando delicatamente per tre o quattro minuti. Quindi rimuovere il wafer dalla soluzione e risciacquare la superficie con isopropanolo. Quindi, posizionare il wafer di silicio in un forno a 150 gradi Celsius per 30 minuti per una cottura dura.
Quindi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di utilizzare la profilometria dello stilo per misurare l'altezza e la pendenza esatte delle pareti laterali del canale. Quindi, erogare un millilitro di resistenza fotografica sulla superficie del vetrino ed eseguire nuovamente il programma. Una volta che il sistema si arresta, spegnere l'aspirapolvere e rimuovere il vetrino.
Dopo aver fissato la maschera fotografica con i disegni dell'elettrodo 2D sul supporto della maschera, inserire e allineare il wafer di vetro con il rivestimento S-1818 rivolto verso l'alto sul mandrino del wafer. Impostare le impostazioni di esposizione per 215 millijoule per centimetro quadrato ed eseguire la macchina. Dopo l'esposizione, immergere il vetrino nella soluzione di sviluppo MF-319 per due minuti, applicando una leggera agitazione.
Quindi rimuovere il wafer di vetro e risciacquare la sua superficie con acqua deionizzata. Infine, posizionare il vetrino nel forno a 150 gradi Celsius per una cottura dura, assicurandosi che la superficie dei substrati di interesse sia rivolta verso l'alto. Dopo 30 minuti, rimuovere il vetrino dal forno e proteggerlo dalla luce.
Per incidere il vetrino immergerlo in una soluzione di acido fluoridrico tamponato 10 a 1 per un minuto in un contenitore di politetrafluoroetilene. Quindi trasferire e lavare i vetrini in acqua deionizzata tre volte. Successivamente, utilizzando un sistema di deposizione fisica da vapore, sputter titanio per otto minuti ad una velocità di 100 angstrom al minuto e platino per 10 minuti a 200 angstrom al minuto.
Quindi, per sollevare la resistenza fotografica, immergere i vetrini rivestiti di metallo in un bagno di acetone per 10 minuti e sonicare il bagno per introdurre agitazione. Se necessario, utilizzare una salvietta imbevuta di acetone per rimuovere eventuali residui. Il prossimo per lo stampaggio replica del polidimetilsilossano rende la base in elastomero PDMS con un indurente con un rapporto di peso di 10 a 1 in un contenitore usa e getta posto sopra una bilancia elettronica.
Quindi, versare la soluzione PDMS sul wafer di silicio e posizionare la miscela sotto vuoto per rimuovere le bolle d'aria. Dopo aver polimerizzato la miscela a 65 gradi Celsius per un minimo di quattro ore, utilizzare la punta di una lama di rasoio per tagliare il PDMS stampato e staccarlo dal wafer di silicio. Quindi, utilizzando un punzone bioptico affilato, rimuovere il PDMS dall'ingresso e dalle uscite del dispositivo.
Quindi, programmare il generatore di plasma per il legame PDMS. Quindi posizionare il PDMS e il vetrino dell'elettrodo nel sistema con le funzionalità rivolte verso l'alto ed eseguire il programma. Al termine del programma, rimuovere i dispositivi e utilizzare uno stereoscopio per allineare rapidamente le caratteristiche del canale agli elettrodi.
Applicare saldamente una pressione dal centro del PDMS verso i lati per rimuovere eventuali bolle d'aria indesiderate sull'interfaccia di incollaggio. Raccogliere le celle HEK293, centrifugarle e risospendere il pellet in tampone di elettroporazione a circa cinque milioni di cellule per millilitro. Quindi, aggiungere la codifica del DNA plasmatico per GFP a una concentrazione finale di 20 microgrammi per millilitro e mescolare delicatamente.
Quindi trasferire la sospensione di cellule plasma-DNA in una siringa di un centimetro cubo per la sperimentazione. Posizionare il microdispositivo sul palco del microscopio tramite un supporto per vetrino. Quindi accendere il dispositivo ad accoppiamento caricato, la fotocamera CCD e mettere a fuoco il canale microfluidico.
Successivamente, per l'elettroporazione a cella singola, impostare la portata della pompa a siringa da 0,1 a 0,3 microlitri al minuto per garantire il flusso di singole celle attraverso il set di elettrodi. Quindi impostare i parametri dell'impulso per l'impulso di elettroporazione iniziale e con la più bassa energia elettrica. Seguire un numero predeterminato di rilevamenti di celle per applicazione a impulsi.
Al termine di ogni condizione testata, aspirare le celle dalla presa del microdispositivo e ricostituire l'uscita con i mezzi di recupero. Passare alla successiva condizione dell'impulso di elettroporazione e ripetere l'operazione fino a testare tutte le condizioni dell'impulso di elettroporazione. Quindi, determinare i parametri dell'impulso di elettroporazione per un feedback basato sulla popolazione ad alta produttività.
Per l'elettroporazione controllata con feedback basato sulla popolazione, impostare la portata della pompa a siringa da uno a tre microlitri al minuto e impostare l'ampiezza dell'impulso sulla condizione ottimizzata. Quindi disattivare la modalità trigger e impostare la larghezza dell'impulso in modo che corrisponda al tempo di transito della cella. Dopo che il numero desiderato di celle è stato elettroporate, spegnere sia la pompa a siringa che il generatore di funzioni.
Quindi trasferire le cellule dal serbatoio di uscita in un pallone o in una piastra di coltura cellulare di dimensioni appropriate riempita con mezzi di recupero preriscaldati e trasferire il pallone o la piastra di coltura in un'incubatrice. Per l'analisi dei dati, caricare i dati in un software di analisi e generare un grafico della corrente rispetto al tempo per ogni condizione pulsante. Quindi determinare il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare, generare la mappa di permeabilizzazione della membrana cellulare su tutte le condizioni di impulso testate e verificare la condizione di pulsazione ottimale.
Dopo l'incubazione, acquisire immagini di epifluorescenza utilizzando filtri FITC e far red e analizzare i set di immagini manualmente o tramite un algoritmo. Qui vengono evidenziati i principi operativi alla base del rilevamento della permeabilizzazione a livello di singola cella per una singola ampiezza di impulso. Dopo ogni parametro dell'impulso di elettroporazione, viene testato il successivo impulso di elettroporazione a più alta energia.
La mappa di permeabilizzazione della membrana cellulare per le cellule HEK293 ha mostrato una correlazione distinta tra l'energia elettrica applicata e il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare. In questo esperimento, un'intensità del campo elettrico di 1,8 kilovolt per centimetro e un impulso di 670 microsecondi è stato determinato come ottimale. A questi valori, è stata raggiunta un'efficienza elettro-trasfezionale del 70%.
In contrasto con un'intensità del campo elettrico di 0,4 kilovolt per centimetro e una durata dell'impulso di tre millisecondi, l'efficienza di elettro-trasfezione a 24 ore era inferiore al 5%Il termine ricetta, che viene spesso utilizzato quando si descrive la specifica del processo di micro fabbricazione, inserisce l'importanza di seguire o ottimizzare ogni passaggio per fabbricare con successo un dispositivo funzionante. Questa tecnologia di elettroporazione può essere utilizzata in ulteriori progetti di ricerca biomedica come la generazione e il test di cellule T CAR o l'ottimizzazione e il test delle tecniche di editing genetico CRISPR-Cas9. Questa tecnologia di micro-elettroporazione consente l'interrogazione elettrica delle risposte di diversi tipi di cellule per applicare le condizioni di pulsazione elettrica e correlare tali informazioni alla consegna di carichi molecolari clinicamente rilevanti.
