Gli arti ricombinanti sono un potente modello per uno studio nel processo di differenziazione cellulare e formazione di potenza sotto l'influenza di segnali embrionali in un ambiente in vivo. Questo test consente molteplici variazioni che consentono potenziali applicazioni senza essere limitato alla biologia dello sviluppo degli arti di pollo. Può essere applicato ad altri steli o progenitori di altri organismi.
Per iniziare, rimuovere le uova dall'incubatrice dopo tre giorni e mezzo, tamponare con etanolo al 70% e lasciarle asciugare all'aria. Quindi, identificare e localizzare gli embrioni in via di sviluppo candificando l'uovo e osservando i vasi sanguigni. Scartare le uova che non hanno un embrione.
Toccare l'estremità smussata del guscio d'uovo con l'estremità di un paio di pinze smussate per aprire una finestra e rimuovere circa un centimetro quadrato del guscio usando la pinza. Quindi trasferire le uova su un supporto di plastica o cartone. Posiziona le uova una per una sotto lo stereomicroscopio.
Identificare la membrana dell'aria e rimuoverla raccogliendo un piccolo foro nell'area senza vasi. Estrarre quest'area con l'aiuto di una pinza chirurgica fine e rimuovere pezzi di guscio d'uovo a contatto con l'embrione. Strappare aprire il sacco amniotico con una pinza chirurgica fine.
Rimuovere con cura l'embrione dall'uovo con una pinza smussata e trasferirlo in una capsula di Petri sterile contenente 1 PBS ghiacciato. Lavare gli embrioni una volta in PBS 1x ghiacciato e prelevare le membrane rimanenti sotto lo stereomicroscopio. Quindi individuare i boccioli posteriori.
Tagliare longitudinalmente ogni gemma posteriore, tagliando molto vicino al fianco dell'embrione con una pinza chirurgica fine. Mantenimento degli embrioni in 1x PBS. Quindi trasferire le gemme degli arti in un tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri con una pipetta di trasferimento in plastica.
Quindi, sostituire il PBS con 500 microlitri di soluzione di tripsina allo 0,5%. Incubare le gemme degli arti in un termoblocco per sette minuti a 37 gradi Celsius. Quindi sostituire la soluzione di tripsina con 500 microlitri di due milligrammi per millilitro collagenasi di tipo quattro in HBSS e incubarla nel termoblocco per altri otto minuti.
Rimuovere quanta più collagenasi possibile e sostituirla con un millilitro di DMEM freddo ad alto glucosio con il 10% fbS per inattivare gli enzimi. Pipettare delicatamente il composto circa 10 volte. Filtrare la sospensione contenente le cellule con un filtro cellulare da 70 micrometri per lasciare dietro di sé gli ectodermi.
Pipettare nuovamente la sospensione da cinque a 10 volte e centrifugare a 200 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi scartare il surnatante. Lavare la collagenasi in eccesso con un millilitro di media, quindi centrifugare la sospensione e scartare il mezzo con attenzione.
Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di media senza disturbare le cellule e incubarle per una a 1,5 ore a 37 gradi Celsius in un termoblocco, consentendo alle cellule di formare un pellet compatto. Dopo aver ottenuto le gemme degli arti posteriori, trasferirle in un tubo micro centrifugo vuoto con una pipetta di plastica. Rimuovere l'eventuale eccesso di 1x PBS e sostituirlo con 500 microlitri di tripsina allo 0,5% in PBS 1x sterile.
Incubare la miscela per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un termoblocco. Trasferire la soluzione di tripsina con le gemme degli arti in una capsula di Petri sterile. Quindi rimuovere il più possibile la tripsina in eccesso e inondare la capsula di Petri con 1x PBS ghiacciato con il 10% fbS fino a quando tutte le gemme degli arti sono coperte.
Identificare le gemme degli arti sotto lo stereomicroscopio. Quindi, identificare l'ectoderma come una membrana trasparente leggermente staccata dalle cellule mesodermiche dell'arto. Staccare e separare l'ectoderma con una pinza che tiene l'estremità più prossimale della gemma dell'arto con una pinza chirurgica fine.
Prendi il pellet mesodermico dai passaggi precedenti e scarta circa 600 microlitri del mezzo. Quindi staccare con cura il pellet con una punta a pipetta senza romperlo. Capovolgere il tubo per trasferire il pellet nella capsula di Petri contenente gli ectodermi vuoti.
Tagliare un piccolo pezzo del pellet con un paio di pinze chirurgiche fini e posizionarlo il più vicino possibile all'ectoderma. Aprire l'ectoderma con la pinza chirurgica e posizionare il pellet il più strettamente possibile nella sala ectodermica. Aprire il sacco amniotico vicino all'arto anteriore per esporre il fianco destro dell'embrione.
Guidato dalla posizione dell'arto anteriore, eseguire il graffio della ferita con un ago di tungsteno della lunghezza di due o tre somiti, danneggiando leggermente il mesoderma fino a quando non sanguina. Trasferire individualmente gli arti ricombinanti nell'embrione di pulcino, posizionando la sua base su una ferita somita. Fissare correttamente l'arto ricombinante con due pezzi di filo di palladio.
Allineare la base dell'arto ricombinante con la ferita. Sigillare la finestra con del nastro adesivo e restituire l'uovo all'incubatrice. Nell'impianto di successo, l'arto ricombinante è stato osservato come una protuberanza che è stata saldamente attaccata alla parete mesodermica dell'embrione donatore.
Al contrario, l'arto ricombinante è stato staccato dalla parete mesodermica o ha presentato una morfologia approssimativa quando la vitalità cellulare o l'innesto hanno fallito. La colorazione blu alciana ha dimostrato elementi scheletrici in un pollo di sei giorni, un arto ricombinante di pollo. Prima di cancellare il blu di Alcian, sono state ottenute immagini in etanolo per misurazioni morfologiche e quantitative.
Gli arti macchiati o non macchiati di H & E sono stati tagliati per osservare tessuti e cellule. Questa tecnica può sviluppare organoidi degli arti in vivo e studiare la differenziazione cellulare o il processo morfogenetico utilizzando le cellule staminali di diverse fonti o specie.
