Il nostro protocollo descrive la progettazione, l'assemblaggio e la convalida della diagnostica basata su circuiti genici. Queste diagnosi molecolari cartacee sono a basso costo e sensibili, essendo in grado di rilevare concentrazioni clinicamente rilevanti di acidi nucleici e possono essere progettate per rilevare praticamente qualsiasi sequenza. Questa è una tecnologia di piattaforma che può essere progettata dagli utenti per le loro esigenze e ha il potenziale per portare la diagnostica di livello clinico in impostazioni di risorse dentali più decentralizzate.
Il sensore Toehold Switch senza celle può essere progettato praticamente per qualsiasi bersaglio basato su acidi nucleici. Recenti lavori hanno dimostrato la diagnostica priva di cellule per Ebola, norovirus, SARS-CoV-2, C.difficile e batteri che causano il tifo. A dimostrare la procedura saranno Severino Jefferson Rivero da Silva, un borsista post-dottorato, e Pouriya Bayat, uno studente di dottorato del mio laboratorio.
Per progettare l'interruttore di appiglio, identificare le sequenze target dal genoma del virus Zika e scegliere le sequenze target del virus Zika dagli ampliconi come descritto nel protocollo di testo. Scarica il pacchetto software di progettazione di toehold switch. Apri MATLAB e vai alla cartella del software di progettazione.
Immettere le sequenze di destinazione nel file csv del file di input di progettazione che si trova nella sottocartella di input. Selezionare i parametri da utilizzare per la funzione di progettazione. Eseguire la funzione di progettazione per generare i progetti dell'interruttore di appoggio per gli obiettivi di interesse.
Al termine, passare alla cartella final_designs e individuare le sequenze di progettazione dell'interruttore top toehold e le sequenze di destinazione corrispondenti nei fogli di calcolo in formato csv. Assicurarsi che le sequenze di DNA del toehold switch generate dall'algoritmo contengano le sequenze del promotore T7 all'estremità cinque prime e una sequenza conservata di 21 linker nucleotidici all'estremità dei tre primi. Utilizzare NCBI BLAST per schermare le sequenze di progettazione dell'interruttore topehold contro altri virus comuni controllando l'omologia della sequenza.
Accetta sequenze con meno del 40% di emologia. Preparare soluzioni di oligo DNA a forcina e primer ad amplificazione inversa ad una concentrazione di 10 micromolari in acqua priva di nucleasi. Assemblare le reazioni in provette PCR sul ghiaccio secondo questa tabella.
Posizionare i tubi di reazione in un termociclatore, seguendo le condizioni di ciclo elencate in questa tabella. Analizzare i prodotti PCR su un gel di agarosio. Purificare i prodotti della PCR ed eluire il DNA in un volume minimo di acqua priva di nucleasi per garantire una concentrazione sufficientemente elevata.
Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro. Preparare una soluzione madre CPRG sciogliendo 25 milligrammi di polvere in un millilitro di acqua priva di nucleasi. Preparare un master mix su ghiaccio secondo il protocollo standard mostrato qui.
Erogare la miscela master priva di cellule in provette per PCR. Per i controlli senza celle e i controlli switch alone, aggiungere acqua priva di nucleasi a un volume di 5,94 microlitri. E per la reazione, aggiungere il DNA dell'interruttore di punta purificato dalla PCR per ottenere una concentrazione finale di 33 nanomolari.
Per testare la combinazione di interruttore toehold e RNA target, aggiungere RNA bersaglio trascritto in vitro a una concentrazione finale di un micromolare. Miscelare accuratamente tutte le reazioni mediante pipettaggio e centrifugare brevemente. Su una piastra nera a fondo chiaro da 384 pozzetti, aggiungere 30 microlitri di acqua priva di nucleasi ai pozzi che circondano i pozzi di reazione.
Quindi, utilizzando un punzone bioptico da due millimetri e una pinzetta, tagliare i dischi di carta da filtro bloccati BSA e posizionarli nei pozzetti di reazione. Erogare 1,8 microlitri da ciascun tubo di reazione sui dischi di carta da filtro nella piastra a 384 pozzetti in triplice copia. Coprire la piastra con pellicola PCR trasparente e posizionarla in un lettore di piastre.
Misurare l'assorbanza a 570 nanometri a 37 gradi Celsius ogni minuto per 130 minuti. Preparare una soluzione madre da 25 micromolari di tutti i set di primer avanti e indietro in acqua priva di nucleasi. Impostare una reazione da cinque microlitri utilizzando il master mix mostrato qui.
Miscelare mediante pipettaggio fino a quando il precipitato bianco si solubilizza e quindi erogare in provette PCR. Aggiungere i primer avanti e indietro ai tubi appropriati, seguiti dall'aggiunta di un microlitro di acqua priva di nucleasi o due picomolar di RNA trigger target. Mescolare con un pipettaggio delicato e ruotare brevemente i tubi.
Impostare il protocollo di incubazione su un termociclatore come mostrato qui. Dopo 12 minuti, rimuovere i tubi e aggiungere 1,25 microlitri della miscela enzimatica a ciascuna provetta, seguita dalla miscelazione e centrifugazione. Riportare i tubi al termociclatore dopo aver saltato il passaggio di attesa di 41 gradi Celsius per iniziare l'incubazione della reazione di un'ora.
Quindi, per valutare le prestazioni del primer, assemblare le reazioni dell'interruttore di appoggio senza cellule basate su carta e analizzare i dati. Per l'analisi di sensibilità, identificare le coppie di primer candidati e preparare diluizioni seriali dell'RNA bersaglio in acqua priva di nucleasi. Ripetere le reazioni NASBA e cell-free con i set di primer selezionati in triplicati biologici.
Utilizzando un microlitro di RNA del paziente estratto, eseguire l'amplificazione NASBA e le reazioni prive di cellule basate su carta come mostrato nella sezione cinque. Dopo le reazioni, preparare la piastra di reazione a 384 pozzetti ed eseguire il test in un lettore di piastre portatile a 37 gradi Celsius. Quindi assemblare i componenti RT-qPCR e aggiungere i reagenti a un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri secondo questa tabella.
Mescolare la reazione mediante pipettaggio. Erogare 6,5 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti o 384 pozzetti, seguita da 3,5 microlitri di ciascun modello di RNA in triplice copia. Posizionare un film PCR sulla parte superiore della piastra.
Centrifugare la piastra a 384 pozzetti a 600 volte G per due minuti. Posizionare la piastra in una macchina RT-qPCR ed eseguire le condizioni di ciclo come mostrato qui. Seguendo il disegno computazionale, sono stati costruiti e analizzati tre interruttori di appiglio utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.
Una banda di circa 3.000 coppie di basi ha indicato una reazione di successo. Gli interruttori di appiglio sono stati valutati rispetto ai rispettivi RNA trigger trascritti in vitro. Mentre tutti e tre i sensori mostravano un aumento dell'assorbanza, il sensore 27B aveva la velocità di accensione più rapida, mentre gli interruttori 33B e 47B avevano un rapporto on/off inferiore che indicava attività in background e specificità ridotta.
Il cambio di piega dell'assorbanza a 570 nanometri ha mostrato che lo switch 27B ha le migliori prestazioni con un rapporto segnale on/off. Inoltre, quando accoppiato con NASBA, può rilevare RNA a concentrazioni fino a 124 molecole per microlitro che indicano un'alta sensibilità. I campioni di pazienti con virus Zika provenienti dal Brasile sono stati testati per valutare l'accuratezza diagnostica clinica dei sensori utilizzando un lettore di piastre portatile.
Un cambiamento di colore dal giallo al viola ha identificato un campione positivo. La risposta colorimetrica per ogni reazione cartacea è stata tracciata nel tempo dal software integrato sul lettore di piastre portatile PLUM. I campioni che hanno superato la soglia sono stati considerati positivi.
Le prestazioni cliniche del sensore sono state stabilite rispetto a RT-qPCR. I campioni sono stati considerati positivi quando il valore soglia del ciclo era uguale o inferiore a 38. È importante assicurarsi che i risultati degli schermi degli interruttori toehold e della sensibilità del primer NASBA siano riproducibili e ottimizzati prima di procedere con gli studi sui pazienti.
Data la sua semplicità e adattabilità, la piattaforma diagnostica qui descritta ha aperto la strada allo sviluppo di nuovi strumenti point of care che possono portare benefici al sistema sanitario, in particolare per i paesi a basso reddito.
