Questo protocollo consente lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle rane. Le conoscenze acquisite potrebbero fornire nuove intuizioni per capire come gli esseri umani rispondono alle lesioni del midollo spinale. Il vantaggio principale di questo protocollo è la facilità nell'eseguire la lesione, e anche che rispetto al paradigma dell'amputazione della coda, questa tecnica imita meglio ciò che accade nell'uomo.
Questa tecnica permette di sfidare il processo rigenerativo per comprendere meglio la partecipazione di diversi geni, proteine, molecole e vie di segnalazione, identificando così nuovi bersagli terapeutici, Il trovare il posto giusto per generare la lesione, così come la sua estensione, è difficile. Essere in grado di vedere questi passaggi è fondamentale per rendere questa procedura semplice e riproducibile. Tre o quattro settimane dopo la fecondazione, posizionare i girini in una capsula di Petri e controllare la morfologia e l'aspetto degli arti anteriori e posteriori.
Cerca le seguenti caratteristiche anatomiche degli animali allo stadio 50, degli arti anteriori che stanno appena apparendo e sono sferici e degli arti posteriori che sono sporgenti e sferici. Prima dell'intervento chirurgico, anestetizzare i girini mettendoli in 0,02% di tricaina mesilato in soluzione di Barth 0,1 volte e controllare che gli animali non rispondano capovolgendoli. Per eseguire la chirurgia di trasezione del midollo spinale, utilizzare un cucchiaio e una pinza per posizionare un girino di scena 50 anestetizzato sul lato dorsale su un pezzo di garza bagnato nella metà superiore di una capsula di Petri di vetro.
Quindi, usando le forbici a molla per microdissezione, fai un'incisione della pelle e dei muscoli dorsali a livello medio-toracico. Per controllare gli animali finti, assicurarsi che la dimensione dell'incisione sia di soli 0,2 millimetri e non danneggi il midollo spinale. Negli animali transettati, fare una seconda incisione di 0,2 millimetri per transect completamente il midollo spinale.
Dopo l'intervento chirurgico, trasferire i girini in un serbatoio contenente 500 millilitri di 0,1 volte la soluzione di Barth con una volta penicillina e streptomicina ad una densità da 10 a 12 girini per serbatoio. Mantieni i girini transettati e controlla i girini fittizi in serbatoi separati. Mantenere i girini con aerazione a una temperatura compresa tra 20 e 21 gradi Celsius.
Cambiare la soluzione di Barth con antibiotici a giorni alterni fino alla fine dell'esperimento. Inizia a nutrire i girini un giorno dopo l'intervento chirurgico ed elimina gli animali morti. Per il test di nuoto, ottenere una scatola con illuminazione a LED dall'interno, coperta da un foglio di polistirolo trasparente che consente il passaggio della luce, e installare una telecamera sopra la scatola LED.
Quindi, posizionare una capsula di Petri di 15 centimetri di diametro sopra la scatola riempita con 100 millilitri di soluzione di Barth 0,1 volte. Un giorno dopo la traslazione, posiziona un girino nella capsula di Petri e lascialo per un periodo di adattamento di cinque minuti. Dopo l'adattamento, inizia a monitorare il video del comportamento di nuoto libero utilizzando il software di riferimento per cinque minuti.
Una volta completato il video, trasferisci il girino nel suo serbatoio. Questo dot plot rappresentativo mostra il recupero della funzione motoria nel tempo. Cinque giorni dopo la transezione, i girini hanno nuotato in media 0,7 metri in cinque minuti, mostrando una ridotta capacità di nuoto.
Questa capacità è aumentata con il passare dei giorni, mostrando una media di 2,1 metri in cinque minuti dopo 10 giorni e 3,1 metri in cinque minuti dopo 15 giorni dopo la transezione. Il recupero completo delle capacità di nuoto è stato osservato a 20 giorni dopo la transezione, con una media di 5,7 metri in cinque minuti. La media di nuoto può variare a seconda di ogni lotto di animali.
Pertanto, il gruppo sperimentale dovrebbe sempre essere confrontato con i rispettivi controlli e non con i dati precedentemente ottenuti. Dopo l'intervento chirurgico, gli animali possono essere utilizzati per l'analisi globale, tra cui trascrittomica, proteomica e metabolomica, e per lo screening di composti che inibiscono o promuovono la rigenerazione del midollo spinale, con l'obiettivo di sviluppare nuovi approcci terapeutici.
