Este protocolo permite o estudo da regeneração da medula espinhal em sapos. O conhecimento adquirido poderia fornecer novas percepções para entender como os humanos respondem à lesão medular. A principal vantagem deste protocolo é a facilidade na realização da lesão, e também que em comparação com o paradigma da amputação da cauda, essa técnica imita melhor o que acontece em humanos.
Essa técnica permite desafiar o processo regenerativo para entender melhor a participação de diferentes genes, proteínas, moléculas e caminhos de sinalização, identificando assim novos alvos terapêuticos, é difícil encontrar o lugar certo para gerar a lesão, bem como sua extensão. Ser capaz de ver esses passos é crucial para tornar este procedimento simples e reprodutível. Três a quatro semanas após a fertilização, coloque os girinos em uma placa de Petri e verifique a morfologia e aparência dos membros da frente e membros traseiros.
Procure as seguintes características anatômicas dos animais estágio-50, membros do antenão que estão apenas aparecendo e são esféricos, e membros traseiros que são salientes e são esféricos. Antes da cirurgia, anestesiar os girinos colocando-os em mesílato de 0,02% tricaine em 0,1 vezes solução Barth, e verifique se os animais não respondem virando-os de cabeça para baixo. Para realizar a cirurgia de transecção da medula espinhal, use uma colher de sopa e fórceps para colocar um lado dorsal anesthetizado estágio-50 girino em um pedaço molhado de gaze na metade superior de uma placa de petri de vidro.
Em seguida, usando uma tesoura de mola de microdisseção, faça uma incisão da pele e músculos dorsais no nível midtorácico. Para o controle de animais falsos, certifique-se de que o tamanho da incisão é de apenas 0,2 milímetros e não danifique a medula espinhal. Nos animais transeccionados, faça uma segunda incisão de 0,2 milímetros para transectar totalmente a medula espinhal.
Após a cirurgia, transfira os girinos para um tanque contendo 500 mililitros de solução 0,1 vezes Barth com uma vez penicilina e estreptomicina a uma densidade de 10 a 12 girinos por tanque. Mantenha os girinos transectados e controle em tanques separados. Mantenha os girinos com aeração a uma temperatura de 20 a 21 graus Celsius.
Mude a solução Barth com antibióticos a cada dois dias até o final do experimento. Comece a alimentar os girinos um dia após a cirurgia e elimine os animais mortos. Para o ensaio de natação, obtenha uma caixa com iluminação LED por dentro, coberta com uma folha transparente de poliestireno permitindo a passagem de luz, e instale uma câmera sobre a caixa led.
Em seguida, coloque uma placa de Petri de 15 centímetros de diâmetro em cima da caixa cheia com 100 mililitros de solução barth de 0,1 vezes. Um dia após a transeção, coloque um girino na placa de Petri e deixe-o por um período de adaptação de cinco minutos. Após a adaptação, inicie o rastreamento de vídeo do comportamento de natação livre usando o software de referência por cinco minutos.
Depois que o vídeo for concluído, transfira o girino de volta para o tanque. Este gráfico representativo mostra a recuperação da função motora através do tempo. Cinco dias após a transeção, girinos nadaram em média 0,7 metros em cinco minutos, mostrando uma capacidade reduzida de natação.
Essa capacidade aumentou com os dias de passagem, mostrando uma média de 2,1 metros em cinco minutos após 10 dias, e 3,1 metros em cinco minutos após 15 dias após a transeção. A recuperação completa das capacidades de natação foi observada aos 20 dias após a transeção, com média de 5,7 metros em cinco minutos. A média de natação pode variar dependendo de cada lote de animais.
Assim, o grupo experimental deve ser sempre comparado aos respectivos controles e não os dados obtidos previamente. Após a cirurgia, os animais podem ser usados para análise global, incluindo transcriptômica, proteômica e metabolômica, e para testar compostos que inibam ou promovam a regeneração da medula espinhal, visando desenvolver novas abordagens terapêuticas.
