Bu protokol, kurbağalarda omurilik rejenerasyonunun incelenmesine izin verir. Edinilen bilgiler, insanların omurilik yaralanmasına nasıl tepki verdiğini anlamak için yeni bilgiler sağlayabilir. Bu protokolün temel avantajı, yaralanmanın gerçekleştirilmesindeki kolaylıktır ve ayrıca kuyruk amputasyonu paradigmasına kıyasla, bu tekniğin insanlarda olanları daha iyi taklit etmesidir.
Bu teknik, farklı genlerin, proteinlerin, moleküllerin ve sinyal yollarının katılımını daha iyi anlamak için rejeneratif sürece meydan okumayı sağlar, böylece yeni terapötik hedefler belirler, Yaralanmayı üretmek için doğru yeri bulmak ve bunun uzantısı zordur. Bu adımları görebilmek, bu prosedürü basit ve tekrarlanabilir hale getirmek için çok önemlidir. Döllenmeden üç ila dört hafta sonra, kurbağa yavrularını bir Petri kabına yerleştirin ve ön bacakların ve arka bacakların morfolojisini ve görünümünü kontrol edin.
Aşama-50 hayvanlarının aşağıdaki anatomik özelliklerini, yeni ortaya çıkan ve küresel olan ön bacakları ve çıkıntılı ve küresel olan arka bacakları arayın. Ameliyattan önce, kurbağa yavrularını 0.1 kat Barth çözeltisinde% 0.02 trikain mesilat içine yerleştirerek anestezi yapın ve baş aşağı çevirerek hayvanların yanıt vermediğini kontrol edin. Omurilik transeksiyonu ameliyatını gerçekleştirmek için, bir bardak Petri kabının üst yarısındaki ıslak bir gazlı bez parçası üzerine anestezi uygulanmış bir aşama-50 kurbağa yavrusu sırt tarafını yerleştirmek için bir çorba kaşığı ve forseps kullanın.
Daha sonra, mikrodiseksiyon yay makası kullanarak, orta torasik seviyede cilt ve dorsal kasların bir kesisini yapın. Kontrol sahte hayvanları için, kesi boyutunun sadece 0,2 milimetre olduğundan ve omuriliğe zarar vermediğinden emin olun. Transekte hayvanlarda, omuriliği tamamen transekte etmek için 0.2 milimetrelik ikinci bir kesi yapın.
Ameliyattan sonra, kurbağa yavrularını, tank başına 10 ila 12 kurbağa yavrusu yoğunluğunda bir kez penisilin ve streptomisin içeren 500 mililitre 0.1 kat Barth çözeltisi içeren bir tanka aktarın. Transekte edilmiş kurbağa yavrularını ayrı tanklarda tutun ve kontrol edin. Kurbağa yavrularını havalandırma ile 20 ila 21 santigrat derece sıcaklıkta tutun.
Barth çözeltisini, deneyin sonuna kadar her gün antibiyotiklerle değiştirin. Kurbağa yavrularını ameliyattan bir gün sonra beslemeye başlayın ve ölü hayvanları ortadan kaldırın. Yüzme testi için, ışığın geçmesine izin veren şeffaf bir polistiren levha ile kaplanmış, içeriden LED aydınlatmalı bir kutu alın ve LED kutusunun üzerine bir kamera takın.
Ardından, 100 mililitre 0.1 kat Barth çözeltisi ile doldurulmuş kutunun üzerine 15 santimetre çapında bir Petri kabı yerleştirin. Transeksiyon sonrası bir gün, Petri kabına bir kurbağa yavrusu yerleştirin ve beş dakikalık bir adaptasyon süresi boyunca bırakın. Uyarlamadan sonra, referans yazılımı kullanarak serbest yüzme davranışını beş dakika boyunca izlemeye başlayın.
Video tamamlandıktan sonra, kurbağa yavrusunu tankına geri aktarın. Bu temsili nokta grafiği, motor fonksiyonunun zaman içinde geri kazanılmasını gösterir. Transeksiyondan beş gün sonra, kurbağa yavruları beş dakikada ortalama 0,7 metre yüzdü ve yüzme kapasitesinin azaldığını gösterdi.
Bu kapasite geçen günlerle birlikte artmış, 10 gün sonra beş dakikada ortalama 2,1 metre, transeksiyon sonrası 15 gün sonra beş dakikada 3,1 metre olarak gerçekleşmiştir. Transösiyondan sonraki 20 günde, beş dakikada ortalama 5,7 metre ile yüzme kapasitelerinin tamamen iyileşmesi gözlendi. Yüzme ortalaması, her hayvan grubuna bağlı olarak değişebilir.
Bu nedenle, deney grubu her zaman ilgili kontrollerle karşılaştırılmalı ve daha önce elde edilmemiş veriler elde edilmelidir. Ameliyattan sonra, hayvanlar transkriptomik, proteomik ve metabolomik dahil olmak üzere küresel analiz için ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmeyi amaçlayan omurilik rejenerasyonunu inhibe eden veya teşvik eden bileşikleri taramak için kullanılabilir.
