이 프로토콜은 개구리에서 척수 재생의 연구를 허용합니다. 습득 한 지식은 인간이 척수 손상에 어떻게 반응하는지 이해하는 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 큰 장점은 부상을 수행하는 용이성이며, 꼬리 절단의 패러다임과 비교하여이 기술은 인간에서 일어나는 일을 더 잘 모방한다는 것입니다.
이 기술은 다른 유전자, 단백질, 분자 및 신호 전달 경로의 참여를보다 잘 이해하기 위해 재생 과정에 도전 할 수있게하여 새로운 치료 목표를 확인함으로써 부상을 발생시키기위한 올바른 장소를 찾는 것뿐만 아니라 그 확장이 어렵습니다. 이러한 단계를 볼 수 있는 것은 이 절차를 간단하고 재현 가능하게 만드는 데 매우 중요합니다. 수정 후 삼 ~ 사주 후에 올챙이를 페트리 접시에 넣고 앞다리와 뒷다리의 형태와 모양을 확인하십시오.
50 단계 동물의 해부학 적 특성, 방금 나타나고 구형 인 앞다리, 튀어 나와 구형 인 뒷다리의 해부학 적 특성을 찾으십시오. 수술 전에 올챙이를 0.1 배 Barth 용액의 0.02 % tricaine mesylate에 넣어 마취시키고 동물을 거꾸로 뒤집어서 반응하지 않는지 확인하십시오. 척수 횡단 수술을 수행하려면 큰 스푼과 포셉을 사용하여 마취 된 단계 -50 올챙이 등쪽을 유리 페트리 접시의 상반부에있는 젖은 거즈 조각에 올려 놓습니다.
그런 다음 미세 해부 스프링 가위를 사용하여 흉부 중부 수준에서 피부와 등쪽 근육을 절개하십시오. 가짜 동물을 통제하려면 절개 크기가 0.2 밀리미터에 불과하고 척수를 손상시키지 않도록하십시오. 횡단 된 동물에서 척수를 완전히 횡단하기 위해 0.2 밀리미터의 두 번째 절개를하십시오.
수술 후, 올챙이를 탱크 당 10 ~ 12 올챙이의 밀도로 1 회 페니실린과 스트렙토 마이신으로 0.1 배 바르트 용액 500 밀리리터가 들어있는 탱크로 옮깁니다. 횡단 된 가짜 올챙이를 별도의 탱크에 유지하고 제어하십시오. 올챙이를 폭기로 섭씨 20 ~ 21 도의 온도에서 유지하십시오.
실험이 끝날 때까지 매일 항생제로 Barth 용액을 변경하십시오. 수술 후 하루 만에 올챙이에게 먹이를 주고 죽은 동물을 제거하세요. 수영 분석의 경우 내부에서 LED 조명이있는 상자를 얻고 빛이 통과 할 수있는 투명한 폴리스티렌 시트로 덮여 LED 상자 위에 카메라를 설치하십시오.
그런 다음 직경 15cm 페트리 접시를 0.1 배 Barth 용액 100 밀리리터로 채워진 상자 위에 놓습니다. 트랜섹션 후 어느 날, 페트리 접시에 올챙이를 넣고 다섯 분의 적응 기간 동안 그대로 두십시오. 적응 후, 다섯 분 동안 참조 소프트웨어를 사용하여 자유 수영 행동을 추적하는 비디오를 시작하십시오.
비디오가 완료되면 올챙이를 다시 탱크로 옮깁니다. 이 대표적인 점도표는 시간을 통한 운동 기능의 회복을 보여줍니다. 횡단 후 5 일 후, 올챙이는 5 분 만에 평균 0.7 미터를 수영하여 수영 능력이 감소한 것으로 나타났습니다.
이 용량은 통과 일에 따라 증가하여 10 일 후 5 분 만에 평균 2.1 미터, 횡단 후 15 일 후 5 분 만에 3.1 미터를 보였습니다. 수영 능력의 완전한 회복은 횡단 후 20 일에서 관찰되었으며, 5 분 만에 평균 5.7 미터가 관찰되었습니다. 수영 평균은 각 동물 배치에 따라 달라질 수 있습니다.
따라서, 실험 그룹은 항상 이전에 획득된 데이터가 아닌 각각의 대조군과 비교되어야 한다. 수술 후 동물은 전사체학, 단백체학, 대사체학을 포함한 글로벌 분석에 사용될 수 있으며, 척수 재생을 억제하거나 촉진하는 화합물을 스크리닝하여 새로운 치료 접근법 개발을 목표로 할 수 있습니다.
