Este protocolo permite el estudio de la regeneración de la médula espinal en ranas. El conocimiento adquirido podría proporcionar nuevos conocimientos para comprender cómo responden los humanos a la lesión de la médula espinal. La principal ventaja de este protocolo es la facilidad para realizar la lesión, y también que en comparación con el paradigma de la amputación de la cola, esta técnica imita mejor lo que sucede en los humanos.
Esta técnica permite desafiar el proceso regenerativo para comprender mejor la participación de diferentes genes, proteínas, moléculas y vías de señalización, identificando así nuevas dianas terapéuticas, La búsqueda del lugar adecuado para generar la lesión, así como su extensión, es difícil. Ser capaz de ver esos pasos es crucial para hacer que este procedimiento sea sencillo y reproducible. De tres a cuatro semanas después de la fertilización, coloque los renacuajos en una placa de Petri y verifique la morfología y la apariencia de las extremidades anteriores y posteriores.
Busque las siguientes características anatómicas de los animales en etapa 50, extremidades anteriores que acaban de aparecer y son esféricas, y extremidades posteriores que sobresalen y son esféricas. Antes de la cirugía, anestesiar los renacuajos colocándolos en mesilato de tricaína al 0,02% en solución de Barth 0,1 veces, y comprobar que los animales no responden dándoles la vuelta. Para realizar la cirugía de transección de la médula espinal, use una cucharada y fórceps para colocar un lado dorsal anestesiado de etapa 50 hacia arriba en un trozo húmedo de gasa en la mitad superior de una placa de Petri de vidrio.
Luego, usando tijeras de resorte de microdisección, haga una incisión de la piel y los músculos dorsales a nivel de la parte media. Para los animales simulados de control, asegúrese de que el tamaño de la incisión sea de solo 0,2 milímetros y no dañe la médula espinal. En los animales transectados, haga una segunda incisión de 0,2 milímetros para transectar completamente la médula espinal.
Después de la cirugía, transfiera los renacuajos a un tanque que contenga 500 mililitros de solución de Barth 0.1 veces con una vez penicilina y estreptomicina a una densidad de 10 a 12 renacuajos por tanque. Mantenga el transectado y controle los renacuajos simulados en tanques separados. Mantenga los renacuajos con aireación a una temperatura de 20 a 21 grados centígrados.
Cambie la solución de Barth con antibióticos cada dos días hasta el final del experimento. Comience a alimentar a los renacuajos un día después de la cirugía y elimine a los animales muertos. Para el ensayo de natación, obtenga una caja con iluminación LED desde el interior, cubierta con una lámina de poliestireno transparente que permita el paso de la luz, e instale una cámara sobre la caja LED.
Luego, coloque una placa de Petri de 15 centímetros de diámetro en la parte superior de la caja llena de 100 mililitros de solución de Barth 0.1 veces. Un día después de la transección, coloque un renacuajo en la placa de Petri y déjelo durante un período de adaptación de cinco minutos. Después de la adaptación, comience a rastrear en video el comportamiento de natación libre utilizando el software de referencia durante cinco minutos.
Después de completar el video, transfiera el renacuajo de regreso a su tanque. Este diagrama de puntos representativo muestra la recuperación de la función motora a través del tiempo. Cinco días después de la transección, los renacuajos nadaron un promedio de 0,7 metros en cinco minutos, mostrando una capacidad de natación reducida.
Esta capacidad aumentó con los días de paso, mostrando un promedio de 2,1 metros en cinco minutos después de 10 días, y 3,1 metros en cinco minutos después de 15 días después de la transección. Se observó una recuperación completa de las capacidades de natación a los 20 días después de la transección, con un promedio de 5,7 metros en cinco minutos. El promedio de natación puede variar dependiendo de cada lote de animales.
Por lo tanto, el grupo experimental siempre debe compararse con los controles respectivos y no obtener datos obtenidos previamente. Después de la cirugía, los animales se pueden utilizar para el análisis global, incluyendo transcriptómica, proteómica y metabolómica, y para detectar compuestos que inhiben o promueven la regeneración de la médula espinal, con el objetivo de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos.
