Il protocollo descrive come valutare il danno epatico indotto da farmaci in vitro utilizzando un sistema microfisiologico in grado di mantenere micro tessuti epatici altamente funzionali e metabolicamente attivi per un massimo di quattro settimane. Questo approccio è un modello di coltura cellulare specifico per rilevare con precisione la responsabilità del danno epatico indotto da farmaci per nuovi composti, che è più predittivo rispetto alle colture 2D più semplici o alle colture 3D ancora più complesse. Questa tecnica può essere utilizzata come parte di una batteria di test di sicurezza preclinici per determinare se un composto è sicuro per iniziare lo sviluppo clinico.
È possibile testare un'ampia varietà di modalità. Iniziare a configurare il sistema microfisiologico del fegato collegando il controller alla docking station house in un incubatore per colture cellulari. Assicurarsi che l'essiccante fresco venga aggiunto nel barattolo di essiccazione situato sul retro del controller.
Dopo aver acceso il controller premendo l'interruttore del bilanciere della barca, attendere cinque minuti affinché il sistema si stabilizzi e raggiunga la pressione. Rimuovere ogni piatto dalla confezione. Successivamente, innescare ogni pozzetto aggiungendo 500 microlitri di terreno DMEM avanzato di semina preriscaldato sul lato del serbatoio.
Posizionare il driver sulla docking station nell'incubatore. Al termine, selezionare il programma principale sullo schermo del controller fino a quando il fluido non passa attraverso i supporti del filtro. Per coprire il canale di superficie, riempire tutti i pozzetti con 1,1 millilitri di terreno DMEM avanzato di semina.
Dopo aver posizionato i driver con piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, collegare la docking station ed eseguire il programma di incubazione. Scongelare le fiale di PHH e HJC tenendo le fiale in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando rimane solo una piccola scheggia di ghiaccio. Una volta scongelato, pipettare delicatamente un massimo di due flaconcini di PHH direttamente in una provetta di mezzo di recupero degli epatociti crioconservato preriscaldato, mezzi CHRM.
Quindi utilizzare un millilitro di CHRM per lavare le cellule rimanenti dal criotubo. Pipettare delicatamente gli HKC dal criotubo in 10 millilitri di terreno DMEM avanzato per la semina ghiacciata in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Successivamente, centrifugare separatamente entrambi i tipi di cellule a temperatura ambiente a 100 volte G per 10 minuti.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospendere i PHH nel mezzo DMEM avanzato di semina calda e gli HKC nel mezzo DMEM avanzato di semina ghiacciata utilizzando un millilitro per fiala delle cellule aggiunte al tubo. Risospendere le cellule con una delicata azione dondolante, quindi posizionarle sul ghiaccio. Quando sospeso, contare le celle e registrare la vitalità.
La vitalità della cella deve essere superiore all'85%Quindi, scollegare il driver dalla docking station e posizionare il driver nell'armadio di sicurezza microbiologica o MBSC. Quindi aspirare il fluido da sopra l'impalcatura fino al punto di arresto, al canale e al serbatoio, lasciando un volume morto di 0,2 millilitri nel pozzo di coltura, raggiungendo appena sopra l'impalcatura. Aggiungere 400 microlitri di terreno DMEM avanzato di semina nella camera del pozzo prima di riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma di cambio del supporto per tre minuti.
Dopo tre minuti, scollegare il driver dall'alloggiamento di espansione e reinserirlo in MBSC. Aspirare il fluido dall'impalcatura di cui sopra fino al punto di arresto e all'estremità del serbatoio di ciascun pozzetto, quindi risospendere i PHH facendo oscillare delicatamente il tubo e aggiungendo il volume richiesto della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di coltura. Pipettare accuratamente la sospensione cellulare, assicurando una dispersione uniforme delle cellule attraverso l'impalcatura della piastra.
Risospendere con cautela gli HKC e aggiungere le sospensioni cellulari a ciascun pozzetto di coltura. Una volta che tutti i pozzetti contengono entrambi i tipi di cellule, posizionare il sistema microfisiologico o il driver MPS sulla docking station nell'incubatore senza collegarsi fisicamente per riposare per un'ora. Una volta trascorsa un'ora, collegare il driver all'alloggiamento di espansione ed eseguire il programma di inizializzazione.
Quando il programma si interrompe automaticamente a due minuti, rimuovere il driver dall'incubatore e aggiungere lentamente 1.000 microlitri del mezzo DMEM avanzato di semina al canale per ottenere un volume totale di 1,4 millilitri. Successivamente, spostare le piastre nell'incubatore ed eseguire il resto del programma di semi per otto ore. Il quarto giorno, mettere in pausa il programma sul controller e scollegare il driver e la piastra dalla docking station.
Trasferirli in un MBSC. Utilizzare una pipetta per raccogliere manualmente circa un millilitro di terreno da ciascun pozzetto per l'analisi dei biomarcatori solubili senza disturbare la coltura cellulare toccando l'impalcatura. Etichettare i terreni raccolti come campioni del quarto giorno ed eseguire saggi di lattato deidrogenasi e urea come controllo di qualità per garantire che la semina abbia avuto successo.
Quindi, dosare ogni pozzetto secondo il piano della piastra eseguendo il cambio del supporto. Al termine, riportare il driver sulla docking station nell'incubatore ed eseguire il programma di incubazione. Il sesto giorno, scollegare il conducente e la piastra dalla docking station e trasferirsi su un MBSC.
Utilizzare una pipetta per raccogliere circa un millilitro di terreno da ciascun pozzetto ed etichettare come campioni post-dose 48 ore e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per i test successivi. L'ottavo giorno, rimuovere le impalcature dalle piastre usando un paio di pinzette e posizionare le impalcature in una piastra da 24 pozzetti contenente 500 microlitri di DPBS senza calcio e magnesio in ciascun pozzetto senza disturbare il micro tessuto. Prendi le istantanee di ogni impalcatura sotto un microscopio a luce invertita a 10 volte l'ingrandimento.
Il quarto giorno, prima del dosaggio del farmaco, è stato eseguito un controllo di qualità dei micro tessuti epatici formati con rilascio di LDH e sintesi dell'urea. L'ottavo giorno, sono state valutate più metriche sanitarie ed epatiche come albumina, urea, CYP tre A quattro, ATP per confermare alti livelli di funzionalità epatica e riproducibilità nei microtessuti. La microscopia in fase di contrasto e la colorazione IF nei microtessuti epatici hanno rivelato la distribuzione uniforme degli HKC nei microtessuti PHH.
L'esposizione acuta dei microtessuti epatici al troglitazone ha causato tossicità, che è stata rilevata dall'alanina aminotransferasi o ALT, e dal rilascio di LDH e da una rapida riduzione della produzione di albumina e urea. Il contenuto di ATP e l'attività del CYP tre A quattro hanno confermato la tossicità causata dal troglitazone e i valori di EC50 erano altamente comparabili ad altri endpoint. Le immagini al microscopio a campo chiaro scattate dopo otto giorni di coltura nell'MPS rivelano un microtessuto epatico sano, uniformemente seminato in tutta l'impalcatura nel controllo del veicolo.
La morte o la degradazione dei tessuti è stata osservata nelle repliche trattate con controllo positivo e troglitazone. Inoltre, è stata studiata anche la tossicità epatica in seguito all'esposizione a pioglitazone. Non è stato rilevato alcun rilascio di LDH o ALT, tuttavia, dopo 48 ore è stata osservata una lieve riduzione della produzione di albumina e urea.
Una lieve riduzione del contenuto di ATP è stata osservata ad alte concentrazioni di pioglitazone. I valori di EC50 sono stati generati dalle curve dose-risposta. La microscopia ha rivelato una leggera alterazione del microtessuto dopo 96 ore di esposizione a pioglitazone alle due concentrazioni più alte testate.
Nello studio, l'uso di cellule di buona qualità e vitalità superiore all'85% è essenziale per generare microtessuti 3D altamente funzionali e sani nel sistema microfisiologico. Seguendo questa procedura, possiamo valutare le interazioni adenina e farmaco-farmaco e il danno epatico indotto da farmaci su modelli di malattia come l'epatite Delta non alcolica o il modello di steatosi epatica non alcolica che utilizza tripla coltura di cellule epatiche parenchimali e non parenchimali.
