Vi mostreremo come preparare la cultura giapponese di quaglie ex ovo e come utilizzare la membrana corioallantoica o CAM in breve per la diagnosi fotodinamica e la terapia del cancro o delle infezioni microbiche. I vantaggi di questo metodo sono una rapida crescita dello sviluppo, piccole dimensioni, un buon accesso al tessuto e una facile manipolazione. Inoltre, rispetta i principi della regola delle 3R per condurre ricerche sugli animali.
Grazie alla sua somiglianza strutturale con le mucose come la vescica, i polmoni o la placenta, è adatto per test in vivo di potenziali farmaci, test di tossicità o studi di trapianto. A dimostrare la procedura saranno Barbora Kundekova e Majlinda Meta, dottorandi del mio laboratorio. Per iniziare, utilizzare uova di quaglia fecondate, fresche o conservate a 10-15 gradi Celsius per un massimo di 4-5 giorni prima dell'inizio dell'incubazione.
Utilizzare solo uova pulite e non danneggiate, quindi incubare le uova in un'incubatrice a tiraggio forzato al 50-60% di umidità e 37,5 gradi Celsius per circa 54 ore posizionate orizzontalmente con le rotazioni delle uova disattivate. Disinfettare la superficie dell'uovo con etanolo al 70% senza ruotare l'uovo. Successivamente, in un armadio a flusso laminare sterile mentre si indossano i guanti, aprire il guscio d'uovo usando piccole forbici chirurgiche sterili e trasferire il contenuto in una piastra di coltura a 6 pozzetti.
Dopo ogni uovo, disinfettare le forbici con etanolo al 70%. Aggiungere circa 5 millilitri di acqua sterile agli spazi vuoti nella piastra a 6 pozzetti poiché l'umidità è essenziale per evitare che il CAM si secchi. Successivamente, aspirare embrioni con punta impropria o uova non fecondate con un aspiratore a vuoto, quindi posizionare gli embrioni in un'incubatrice fino a ulteriori esperimenti mantenendo una temperatura di 37 gradi Celsius nell'80-90% di umidità.
Quando la CAM è abbastanza sviluppata, di solito dal giorno 7 embrionale, posizionare un anello di silicone sterilizzato sulla superficie CAM lungo i piccoli capillari evitando i principali vasi sanguigni. In condizioni sterili, applicare un volume appropriato di soluzione di ipericina 30 microlitri all'anello di silicone e mantenere gli embrioni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con un'umidità compresa tra l'80 e il 90%. Per condurre la diagnosi fotodinamica, illuminare la CAM utilizzando la luce di eccitazione viola e registrare la fluorescenza dell'ipericina e del tessuto CAM e delle cellule tumorali con una fotocamera digitale a diversi intervalli di tempo dopo la somministrazione di ipericina.
Se la ricerca richiede un'immagine della CAM in luce bianca, registrare la CAM prima della somministrazione di ipericina e alla fine dell'esperimento poco prima della fissazione del tessuto, poiché la luce innesca l'attivazione fotografica dell'ipericina. Per eseguire la terapia fotodinamica dopo l'applicazione dell'ipericina, posizionare il CAM sotto la fibra ottica affinché il raggio laser copra l'intera area all'interno dell'anello in silicone. Dopo aver eseguito l'irradiazione in vivo, in questo caso particolare con una luce laser a 405 nanometri ad una velocità di fluenza di 285 milliwatt per centimetro quadrato, registrare CAM utilizzando luce bianca e/o luce fluorescente prima e dopo il trattamento fotodinamico.
Fissare il tessuto CAM in una piastra di coltivazione con paraformaldeide al 4% in PBS per un minimo di 2 ore e un massimo di notte, quindi rimuovere la paraformaldeide e ritagliare accuratamente dalla CAM una parte del tessuto all'interno dell'anello di silicone. Tutti questi passaggi dovrebbero essere eseguiti in una cappa aspirante. Lavare la parte tagliata dal tessuto CAM in acqua per 10 minuti e successivamente disidratare in serie di alcol ascendente ponendo il tessuto CAM in etanolo al 70% per 3 minuti, soluzione di eosina per 2 minuti, throcin 96% etanolo per 5 minuti, 100% etanolo per 5 minuti e due volte in xilene per 10 minuti in una nuova capsula di Petri.
Successivamente, trasferire i campioni il più rapidamente possibile alla paraffina sciolta in piastre di Petri usando una spatola o un pennello sottile. Dopo 24 ore, posizionare il tessuto nello stampo istologico, riempirlo con un mezzo di incorporamento della paraffina e lasciarlo solidificare in frigorifero, quindi tagliare il CAM solidificato dal mezzo di incorporazione, girarlo nel vassoio di 90 gradi, riempirlo nuovamente con il mezzo di incorporazione e lasciarlo solidificare. Preparare sezioni da 5 a 10 micrometri su un microtomo per l'analisi istopatologica per determinare il danno indotto da PDT.
Per preparare le sezioni CAM congelate per l'istologia, montare con cura CAM nativo o paraformaldeide fissa al 4% sul vetrino, riempire lo stampo incorporato a metà con OCT e congelare in azoto liquido o una miscela di ghiaccio secco ed etanolo. Dopo il congelamento, inclinare e far scorrere con attenzione il CAM dal vetrino sulla parte superiore del mezzo OCT congelato. Riporre nello stampo, coprirlo con il mezzo OCT e congelare come descritto in precedenza.
Per l'analisi della vascolarizzazione CAM, sono necessari campioni CAM interi. Nell'armadio a flusso laminare, trabocco CAM con una soluzione di fissazione preriscaldata di 4% aldeide paraforme e 2% glutaraldeide in PBS, quindi rimuovere la soluzione di fissazione dopo 48 ore. Quindi, separare accuratamente la CAM dall'embrione con micro forbici e una spazzola fine e lavarla in PBS, quindi montare la CAM lavata su un vetrino e lasciarla asciugare lentamente.
Successivamente, fotografa la diapositiva utilizzando una fotocamera digitale in un transilluminatore come fonte di luce bianca omogenea. La posizione del tumore sulla superficie CAM è stata visualizzata sotto luce bianca e luce fluorescente dopo l'aggiunta di ipericina. L'analisi istologica ha mostrato strutture concentriche di cellule squamose anomale che invadono i tessuti sani accompagnate da edema e ispessimento della membrana.
Dopo il trattamento con PDT, è stata osservata una chiara differenza nella densità dei vasi all'interno dell'anello e dell'area circostante. La radiazione laser senza la presenza di fotosensibilizzatore non ha causato alcun danno paragonabile al controllo senza alcun trattamento. Dopo 3 ore di incubazione con ipericina, l'irradiazione laser ha provocato fluorescenza causata dalla monomerizzazione dell'ipericina aggregata con danni estesi alla vascolarizzazione.
L'analisi istologica ha rivelato che la CAM di controllo non trattata aveva uno spessore relativamente uniforme. Tuttavia, il trattamento PDT ha fatto sì che la CAM diventasse più sottile e più fragile. Abbiamo appena dimostrato come preparare il test CAM di quaglia ex ovo e come usarlo.
Pur mantenendo le linee guida, questa metodologia è facile da padroneggiare e può rivelarsi risultati rapidi.
