Il significato del protocollo si basa sulla riduzione degli errori umani e della contaminazione microbiologica. Inoltre, responsabile della produzione di migliaia di sferoidi per approcci di bioprinting 3D. Il vantaggio principale di questa questione, tuttavia, è che ha ottimizzato le ore di lavoro.
I parametri del software sono cruciali perché possono influenzare la qualità finale degli sferoidi. E il miglior consiglio sarebbe quello di eseguire test solo con terreni di coltura cellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché si tratta di un vecchio metodo tradizionale di coltura cellulare 3D basato su Begin raccogliendo la sospensione di cellule staminali con una pipetta sierologica da 10 millilitri e trasferendola in un tubo centrifugo da 50 millilitri.
Quindi, centrifugare a 400 RCF per 5 minuti per ottenere il pellet ASC. Risospesciare il pellet cellulare utilizzando DMEM-Low contenente il 10% di FBS. Dopo aver eseguito il conteggio cellulare, prendere ASC in tubi centrifughi separati da 15 millilitri per seminare le recessioni 81 e 256 microstampate con idrogel non aderente.
Fare riferimento al manoscritto di testo per i dettagli del numero di celle utilizzate. Aggiungere 500 microlitri di soluzione sterile di agarosio ultra puro al 2% al centro di uno stampo in silicone contenente 81 o 256 recessi circolari. Dopo 40 minuti, sformare l'agarosio ultra puro dallo stampo in silicone e metterlo in un pozzetto di una piastra di plastica a 12 pozzetti.
Aggiungere due millilitri di DMEM-Low nel pozzo con l'agarosio microstampato e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica atmosferica per almeno 12 ore prima di seminare gli ASC. Assicurarsi che il flusso laminare sia acceso e che il flusso d'aria dell'armadio funzioni correttamente. Verificare che l'apparecchiatura sia collegata alla tensione corretta e che il tablet sia collegato all'apparecchiatura.
Verificare se l'altezza del vetro di protezione dell'armadio è allo stesso livello della marcatura del sensore dell'apparecchiatura. Premere il pulsante di accensione o spegnimento sul lato sinistro dell'apparecchiatura. Quindi, attendere l'avvio del tablet e dell'apparecchiatura.
Posizionare le scatole di punta, il rack per i tubi della centrifuga e la piastra contenente l'idrogel di agarosio microstampato nello spazio di lavoro dell'apparecchiatura. Nel software aperto nel tablet, fare clic su LabWare Editor. Imposta un tavolo di lavoro virtuale e scegli le posizioni delle pipette, delle scatole di punta, del rack per i tubi di plastica e delle piastre.
Fare clic sul pulsante Passa alla procedura"per includere tutti i parametri e i comandi eseguiti dall'apparecchiatura durante l'esperimento. Attendere l'apertura di una barra degli strumenti e di un elenco di procedure nel software. Inizialmente, per indicare i comandi, incorporare il numero di campioni da pipettare e trascinarlo nell'elenco delle procedure.
Quindi, fare clic sul pulsante di comando "trasferimento reagente" sul software per trasferire la sospensione ASC ai pozzetti della piastra a 12 pozzetti contenente i micro stampi e trascinarla nell'elenco delle procedure. Fare clic su "proprietà" per impostare le posizioni di inizio e fine "per l'apparecchiatura per trasferire il campione. Attendere che il software torni alla pagina Tabella di lavoro.
Impostare i parametri per la semina automatica degli ASC come descritto nel manoscritto di testo. Selezionare l'acqua come tipo di liquido standard. Fare clic sul pulsante "opzioni" per impostare i parametri per creare una sospensione omogenea degli ASC come descritto nel manoscritto di testo.
Fare clic sul pulsante con un simbolo di controllo sulla barra superiore del software per assicurarsi che non vi siano errori di programmazione. Fare clic sul pulsante play"nella barra superiore del software per avviare il programma. Lasciare che l'apparecchiatura inizi come programmato.
E aspetta che emetta un suono che indichi che è finito. Raccogliere la piastra a 12 pozzetti quindi incubarla a 37 gradi Celsius con un apporto di anidride carbonica atmosferica del 5% per almeno 18 ore, per consentire la formazione completa e compatta di sferoidi. Raccogliere manualmente gli sferoidi dopo uno, tre e sette giorni di coltura per l'analisi.
Lavare il mezzo con una micro pipetta per rilasciare gli sferoidi dall'idrogel di agarosio non aderente microstampato. Raccogliere gli sferoidi manualmente utilizzando una micro pipetta e trasferirli in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Un totale di 85 e 160 sferoidi sono stati misurati da idrogel non adesivi microstampati con 81 e 256 recessioni circolari, rispettivamente.
Il sistema di pipette automatiche ha seminato la sospensione della cella ASC in 12 pozzetti di una singola piastra a 12 pozzetti in 15 minuti. Utilizzando l'idrogel non aderente 81 microstampato, ha prodotto 972 sferoidi in questo studio. Mentre i 256 microstampati idrogel non aderenti, hanno prodotto 3072 sferoidi.
Gli sferoidi ASC sono stati analizzati per l'omogeneità delle loro dimensioni e forma. Gli steroidi ASC da micro muffe con 81 recessioni hanno mostrato un diametro omogeneo durante il periodo di coltura. In contrasto con gli steroidi ASC da micro stampi con 256 recessioni, il rapporto di diametri più piccoli e più grandi era vicino a uno negli sferoidi ASC da micro muffe con 81 e 256 recessioni.
La vitalità, la morfologia e le analisi di forza hanno fornito prove per il successo della produzione su larga scala di sferoidi ASC. Il più caso è quello di garantire che il problema sia stato risolto bruscamente senza errori.
