La produzione e il lavoro sperimentale qui presentato riflette l&#39;aiuto devoto ed entusiasta di Reynaldo Pareja. Finanziato dal Dipartimento amministrativo della Colombia della Scienza, tecnologia e innovazione (Colciencias) e da una borsa di studio dalla Fondazione Bill &amp; Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges Explorations iniziativa.

1. Piante <ol><li> Surface-sterilizzare semi di fagiolo (cv. Calima) immergendole per due minuti in ipoclorito di sodio allo 0,5% e due minuti in etanolo al 70%. Sciacquare i semi tre volte in acqua distillata sterile. </li><li> Valutare il successo della vostra sterilizzazione con placcatura 100 pl di l&#39;ultima acqua di risciacquo per patate dextroxe agar (PDA) media, e incubando la piastra per 10 giorni a 25 ° C. Terminare e riavviare l&#39;esperimento se la crescita è visto sul piatto. </li><li> Piantare i semi in gruppi di tre in vasi contenenti una miscela sterile di terra e sabbia con un rapporto 2:1. Trasferire i vasi ad una camera di crescita a 25 ° C, ca. 50% UR e 12 ore fotoperiodo. Una settimana dopo la germinazione, eliminare le due piantine meno vigorose. Acqua, ogni 2-3 giorni con acqua distillata sterile e fertilizzare 10 e 20 giorni dopo la semina con un g / L 6 soluzione acquosa di concime NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Fungo <ol><li> Ottenere un commerformulazione finanziaria di Beauveria bassiana ceppo GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia). </li><li> Per generare una singola spora coltura madre, sospendere ca. uno inoculo anello pieno di conidi in 1 ml di una soluzione acquosa al 0,1% di Triton X-100 e vortex per 10 sec. Poi, piastra 100 microlitri della sospensione sul 2,5% agar Noble e incubare per 24 ore a 25 ° C. Trasferire un singolo conidio germinando in un PDA 100 millimetri piatto contenente e crescere fino a coprire l&#39;intera piastra (circa 3-4 settimane). </li><li> In condizioni di sterilità, raschiare la crescita fungina dalla superficie del terreno e sospendere in 10 ml sterile 0,1% Triton X-100. Vortex per un minuto. Poi, filtrare la sospensione attraverso una garza sterile per rimuovere ife e ottenere la sospensione stock. </li><li> Utilizzare un emocitometro di valutare la concentrazione conidi della sospensione stock. Per facilitare i conteggi conidi, preparare un 10.000 volte diluizione seriale del magazzino, ogni volta che il trasferimento di 100 pl of sospensione di conidi in 900 pl di 0,1% Triton X-100, e di vortex per 10 secondi prima della successiva diluizione. </li><li> Per generare l&#39;inoculo, regolare la sospensione magazzino ad una concentrazione finale di 10 8 conidi / ml, usando la formula: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="equazione 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Per valutare la redditività conidi, piastra 100 microlitri della 10.000 volte diluizione sul 2,5% agar Nobile e incubare per 24 ore a 25 ° C. Quindi, controllare tre gruppi casuali di 100 conidi per stimare la germinazione per cento. Considerare un conidio germinato quando un tubo germe visibile più di metà del diametro dei progetti conidio da esso. Utilizzare solo la sospensione quando la germinazione percentuale media superiore al 90%. </li></ol> 3. Inoculazione <ol><li> Seminare piante quando raggiungono la loro prima fase foglie vere (circa 14 giorni dopo la semina). Le piante acquatiche alla capacità del suolo con sterile distillareed acqua 24 ore prima di vaccinazioni. </li><li> Per il metodo spray fogliare, utilizzare un atomizzatore manuale per applicare la sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) al adaxial (superiore) superficie delle foglie fino a raggiungere la saturazione. Coprire la parte superiore del vaso con un foglio di alluminio per evitare il deflusso conidi al suolo. Dopo la spruzzatura, coprire le piante con un sacchetto di plastica per 24 ore per mantenere un elevato livello di umidità facilitare invasione fungina. </li><li> Per il metodo del suolo drench, utilizzare un cilindro graduato da applicare 10 ml di sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) alla superficie del terreno alla base della pianta. </li><li> Dopo vaccinazioni, tornare impianti alle camere di crescita organizzare in un disegno randomizzato blocco completo. Non meno di quattro blocchi aggiuntivi sperimentali deve essere installato per consentire valutazioni di crescita delle piante, oltre a valutazioni di colonizzazione endofitica, nello stesso esperimento. </li></ol> 4. Evalgenza <ol><li> Valutare l&#39;esperimento un blocco alla volta, selezionando i blocchi in ordine casuale. Ciò è particolarmente importante per gli esperimenti di grandi dimensioni che non possono essere valutati in un solo giorno. </li><li> Prima di elaborare una pianta, misurare e registrare la sua altezza dalla base al meristema apicale. Poi, sradicare con attenzione e lavare accuratamente in acqua corrente. </li><li> Da ogni campione vegetale, due foglioline, due pezzi di radice e due pezzi di stelo. Selezionare casualmente campioni foglietto dalla prima foglia vera della pianta. Quindi, ottenere due campioni staminali, 3 cm di lunghezza ciascuno, dal centro della pianta e dalla prossimità della superficie del terreno. Infine, ottenere due campioni Taproot, anche 3 cm di lunghezza ciascuno, a partire dalla metà della radice e da 1 cm dietro la punta della radice. Porre i campioni in tre sacchetti di carta separati e di etichette in modo appropriato. </li><li> Dopo il lavaggio e campionamento tutte le piante in un blocco, iniziare lavorazione delle foglie, poi le radici, e, infine, i gambi. </li><li> Surface sterilizzare tproblemi in una cappa a flusso laminare sterile come in 1.1, di cui sopra. Lavare ogni campione tre volte per immersione in acqua distillata sterile e lasciare asciugare in un tovagliolo di carta sterile. Poi, sezionare e scartare i suoi bordi esterni, dove endofiti potrebbe essere stato eliminato a causa del contatto con disinfettanti. </li><li> Tagliare il campione tagliato in sei sezioni, con una media 6x6 millimetri per le foglie e 6 mm di lunghezza per steli e radici. Tavola delle sei sezioni su un piatto 60 millimetri Petri con i media PDA integrato con la tetraciclina antibiotici, streptomicina e penicillina a 2 mg / L ciascuno. Sigillare la piastra con parafilm e incubare al buio a 25 ° C. Ogni pianta produce sei piatti, due parti per impianti. </li><li> Cambiare l&#39;acqua di risciacquo dopo l&#39;elaborazione di ogni blocco di una parte dato impianto. Prima di eliminare l&#39;usato acqua di risciacquo, piatto un campione di 100 microlitri su supporti PDA e incubare per 10 giorni a 25 ° C per valutare il successo di sterilizzazione. Se la crescita fungina ne consegue, non considerano i campioni corrispondenti per le analisi. </li><li> Ispezionare le piastre ogni 2-3 giorni per 20 giorni per osservare e registrare la crescita di funghi. Sezioni d&#39;impianto accise e il trasferimento espone presenza di endofiti fungini alle piastre contenenti PDA fresco. Ciò consente di evitare la contaminazione delle sezioni d&#39;impianto connessi applicabili alla piastra originale. </li><li> Record B. crescita bassiana da sezioni dell&#39;impianto. Beauveria bassiana può essere identificato dal caratteristico miceli bianco denso diventando crema a giallo pallido al bordo. In caso di dubbio, montare il campione in una goccia d&#39;acqua e controllare al microscopio, alla ricerca di conidi globosi e zig-zag a forma di conidiofori, caratteristica della specie. </li><li> Utilizzare ulteriori blocchi sperimentali per valutare l&#39;impatto dei trattamenti sulla biomassa vegetale. Primo, misurare l&#39;altezza dalla base alla sommità del meristema apicale. Poi, con attenzione sradicare le piante e lavare in acqua corrente e lasciarli asciugare a 45 ° C per tre giorni per determinare il loro peso secco. </li></ol>

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(15), e683 (2008).</li><li>Parsa, S., Sotelo, G., Cardona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+herbivore+resistance+mechanisms:+spittlebugs+on+Brachiaria+spp.+as+an+example.">Characterizing herbivore resistance mechanisms: spittlebugs on Brachiaria spp. as an example.</a> J. Vis. Exp. (52), e3047 (2011).</li><li>Atamian, H., Roberts, P., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+throughput+screens+with+root-knot+nematodes+Meloidogyne+spp.">High and low throughput screens with root-knot nematodes Meloidogyne spp.</a> J. Vis. Exp. (61), e3629 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento specifico per stabilire una entomopathogen fungina come endophyte. I nostri risultati dimostrano il metodo di inoculazione è uno di loro. Fattori biologici di sperimentare sono il raccolto specie o cultivar selezionata e il ceppo fungina entomopathogen specie o isolare utilizzati. Altri fattori da considerare includono manipolare la concentrazione dell&#39;inoculo, l&#39;età della pianta durante inoculazioni, e condizioni di crescita della pianta. Sarebbe ideale per un metodo di inoculazione di provocare colonizzazione vegetale sistemica da un fungo 14,17,18,21 entomopathogen. Invece, sembra che i metodi di inoculazione tendono a favorire un modello specifico di colonizzazione locale. Nel caffè, per esempio, spray fogliari favorire la colonizzazione foglia mentre inzuppa suolo favorire colonizzazione delle radici 17. Abbiamo trovato lo stesso modello nel fagiolo comune. In definitiva, la scelta del metodo di inoculazione dovrebbe essereguidati dalla posizione prevista del endofiti all&#39;interno di un impianto, presumibilmente corrispondente alla nicchia del erbivoro di destinazione o patogeno per le piante. Anche se comunemente usato, il rilevamento e la quantificazione endofiti basata sulle culture dei media può essere costoso, difficile e soggetto a errori. Ad esempio, un totale di 10.800 sezioni di impianto (piastrate su piastre Petri 1800) sono stati valutati in un esperimento per ottimizzare B. vaccinazioni bassiana su Banana 16. Di questi, 4.496 sezioni sono state colonizzate da un putativo B. bassiana, come individuate principalmente dalla morfologia delle colonie. Chiaramente, una verifica microscopica delle specie per ogni colonia sarebbe stato un passo auspicabile, ma inaccessibile. D&#39;altra parte, 1.176 sezioni sono state colonizzate da funghi e altri sono stati scartati e trattati come dati mancanti 16. La probabilità esiste, tuttavia, che B. bassiana era un concorrente povero o più lento a crescere, e avrebbe potuto eventualmente emerse da queste parti se unllowed tempo sufficiente. Di conseguenza, i metodi di rilevamento endofiti basati sulle culture dei media sono soggetti a falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, lo sviluppo di un rilevamento più affidabile e quantificazione metodi, ad esempio quelle basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) saggi 20,21,24, è ben giustificata. L&#39;obiettivo finale per esperimenti di inoculazione dovrebbe essere quello di sviluppare un trattamento efficace che fornisce duratura resistenza sistemica contro erbivori e / o malattia. Una plausibile, ma ancora non testato, l&#39;ipotesi è che l&#39;entità della colonizzazione endofitica dovrebbe correlata positivamente con il grado di endofiti resistenza mediata. Un naturale passo successivo dopo la rifinitura metodi di inoculazione, quindi, potrebbe essere quello di esaminare la correlazione. Diversi protocolli video può aiutare i ricercatori a progettare un dosaggio adeguato di resistenza per un parassita o patogeno bersaglio 29-31. In definitiva, questo saggio è quello che determina il successo della inoculizione metodo, e il potenziale associato per endofitica controllo biologico.

Entomopatogeni fungine sono importanti regolatori di popolazioni di insetti con un notevole potenziale come mycopesticides 1. Solo recentemente, tuttavia, hanno entomopatogeni fungine stato verificato come endofiti, naturalmente o in risposta a vari metodi di inoculazione 2. La funzione ecologica di endofiti fungini entomopatogeni rimane in gran parte sconosciuta, ma alcuni studi li hanno implicato nella crescita delle piante 3,4, resistenza erbivoro 5-8, e la resistenza alle malattie 9,10. L&#39;obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di introdurre un entomopathogen fungina come endophyte, in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) è il più studiato entomopathogen endofitica fungine 5-9,11-19, ed è disponibile come mycopesticide commerciale. Metodi di inoculazione testato per stabilire <em&gt; B. bassiana come endofiti includono inzuppa suolo 14,17, rivestimenti di semi 18 e immersioni 14, condimenti radichetta 13,15, radici e rizoma immersioni 11,16,18, iniezioni stelo 17, spray fogliari 14,17,20 e spruzzi di fiori 19. Usando questi metodi, i ricercatori hanno introdotto B. bassiana in banane 11, fagiolo 7, cacao 13, caffè 17, mais 7, cotone 7, della palma da datteri 12, iuta 21, papavero da oppio 20, zucca 7, radiata pino 18, sorgo 14, pomodoro 7 e grano 7. Recenti evidenze suggeriscono che endofitica B. bassiana ha il potenziale per proteggere le piante non solo dai parassiti artropodi 5-7,22-27, ma anche da alcuni agenti patogeni delle piante 9. Il fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), si classifica tra le colture più vulnerabili ai parassitie malattie. Esso può essere influenzata da più di 400 e 200 parassiti patogeni, la cui attacco è pensato per essere il più fattore limitante produzione di fagioli tra le regioni 28. Di conseguenza, il fagiolo comune può essere una coltura eccellente modello per esaminare l&#39;intero spettro di endofitica controllo biologico di B. bassiana. Come primo passo in questa direzione, in questo articolo viene descritto spray fogliari e inzuppa suolo come metodi di inoculazione di introdurre B.bassiana come endophyte nel fagiolo comune.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Name of Reagent/Material</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Potato dextrose agar</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Regular bleach (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triple quince (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

establishing fungal entomopathogens as endophytes: towards endophytic biological control

Beauveria bassiana è un entomopathogen fungina con la capacità di colonizzare piante endophytically. Come endophyte, B. bassiana può giocare un ruolo nel proteggere le piante da herbivory e malattia. Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per stabilire B. bassiana endophytically nel fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Le piante sono cresciute da semi sterilizzati in superficie per due settimane prima di ricevere una B. trattamento bassiana di 10 8 conidi / ml (o acqua) applicati sia come spray fogliare o inzuppare suolo. Due settimane più tardi, le piante vengono raccolte e le loro foglie, steli e radici vengono campionati a valutare endofitica colonizzazione fungina. Per questo, i campioni sono individualmente superficie sterilizzati, tagliato in più sezioni, e incubate in media patata destrosio agar per 20 giorni. Il supporto viene controllato ogni 2-3 giorni per osservare la crescita di funghi comesociated con sezioni dell&#39;impianto e registrare il verificarsi di B. bassiana per stimare l&#39;estensione della sua colonizzazione endofitica. Analisi di successo inoculazione confronta il verificarsi di B. bassiana all&#39;interno di una parte dato impianto (cioè le foglie, steli o radici) attraverso trattamenti e controlli. In aggiunta al metodo di inoculazione, l&#39;esito specifico dell&#39;esperimento può dipendere coltura di destinazione o varietà, le specie fungine entomopathogen ceppo o isolare utilizzati, e condizioni di crescita della pianta.

B. bassiana è stato in grado di colonizzare endophytically-P. vulgaris in risposta ai trattamenti inoculazione dimostrato (Figura 1). Sia spray fogliari e inzuppa del suolo ha determinato la colonizzazione endofitica da B. bassiana in oltre l&#39;80% delle piante trattate (Figura 2). Tuttavia, il grado di colonizzazione dipendeva da parte dell&#39;impianto valutata e il metodo di inoculazione utilizzato. Foglie risposto meglio per vaccinazioni a spruzzo. Roots, invece, risposto solo a inoculazioni bagnarsi. Infine, steli risposto analogamente a entrambi i metodi di inoculazione. B. bassiana non è stata rilevata in nessuna delle sezioni dell&#39;impianto di controllo. Indipendentemente dalle endofiti, di trattamento di B. bassiana è cresciuto dal 15% delle sezioni d&#39;impianto valutate, ma sono stati sezionati fuori dalle piastre di supporto prima che potessero invadere sezioni confinanti e influenzare i risultati. Gli impianti di trattamento e di controllo sono visibilmente distinguibili due settimane dopo vaccinazioni. Nessuna differenza è stata rilevata nel loro peso secco e la loro altezza. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. I risultati rappresentativi dei trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di piante di fagiolo (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Da Beauveria bassiana alto a sinistra:. Controllo lamiere senza crescita. In alto a destra: funghi endofiti da una sezione di impianto di contaminare l&#39;intera piastra. In basso a sinistra: B. bassiana crescente da due sezioni di impianto. In basso a destra: endofiti B. bassiana conidi e conidiofori come si è visto al microscopio. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figura 2. Effetto di trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di beaimpianti n (Phaseolus vulgaris cv. Calima) di Beauveria bassiana, due settimane dopo l&#39;inoculazione con GHA ceppo. colonizzazione Percent rappresenta il numero di sezioni di impianto colonizzati diviso per il numero di sezioni di coltura.

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Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen fungina<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Come endophyte nel fagiolo comune (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), In preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.

Stabilire funghi entomopatogeni come endofiti: Verso endofiti Controllo Biologico

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

establishing-fungal-entomopathogens-as-endophytes-towards-endophytic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

34.5K Views.  International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali, Colombia. Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen fungina Beauveria bassiana Come endophyte nel fagiolo comune ( Phaseolus vulgaris), In preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Ricerca

Bioingegneria

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and screening for the selection of a fast-acting, highly virulent entomopathogenic fungus are important steps. Entomopathogenic fungi, such as Metarhizium, Beauveria, and Nomurea, which act by contact, are better suited than Bacillus thuringiensis or nucleopolyhedrosis virus (NPV), which must be ingested by the insect pest. In the present work, we isolated 68 Metarhizium strains from infected insects using a soil dilution and bait method. The isolates were identified by the amplification and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2 and 26S rDNA region. The most virulent strain of Metarhizium anisopliae was selected based on the median lethal concentration (LC50) and time (LT50) obtained in insect bioassays against III-instar larvae of Helicoverpa armigera. The mass production of spores by the selected strain was carried out with solid-state fermentation (SSF) using rice as a substrate for 14 days. Spores were extracted from the sporulated biomass using 0.1% tween-80, and different formulations of the spores were prepared. Field trials of the formulations for the control of an H. armigera infestation in pigeon peas were carried out by randomized block design. The infestation control levels obtained with oil and aqueous formulations (78.0% and 70.9%, respectively) were better than the 63.4% obtained with chemical pesticide.

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Here, we report the different stages involved in the knowledge-based development of an effective mycoinsecticide, including the isolation, identification, screening, and selection of the "best-fit" entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae, for the control of insect pests in agriculture.

Sviluppo di<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Come micosintetizzatore: dall&#39;isolamento al campo

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

Ambiente

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Immunologia e infezioni

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

Isolamento e selezione di funghi entomopatogeni da campioni di suolo e valutazione della virulenza fungina contro gli insetti nocivi

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Biologia

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. The increase in pest resistance to chemical insecticides, the growing concerns regarding the negative effects of insecticides on human health, and the environmental pollution from pesticides have led to a global drive to find novel sustainable strategies for crop protection and pest control. Previously, attempts to mass culture such entomopathogenic fungi (EPF) species as Beauveria bassiana have been conducted. However, only limited attempts have been conducted to mass culture Metarhizium robertsii and M. pinghaense for use against insect pests. This study aimed to mass-produce a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of M. robertsii and M. pinghaense for commercial application. Three agricultural grain products, flaked oats, flaked barley, and rice, were used as the EPF solid fermentation substrates. Two inoculation methods, conidial suspensions and the liquid fungal culture of blastospores were used to inoculate the solid substrates. Inoculation using conidial suspensions was observed to be relatively less effective, as increased levels of contamination were observed on the solid substrates relative to when using the blastospore inoculation method. Flaked oats were found not to be a suitable growth substrate for both M. robertsii and M. pinghaense, as no dry conidia were harvested from the substrate. Flaked barley was found to favor the production of M. robertsii conidia over that of M. pinghaense, and an average of 1.83 g &plusmn; 1.47 g of dry M. robertsii conidia and zero grams of M. pinghaense conidia was harvested from the substrate. Rice grains were found to favor the conidial mass production of both M. pinghaense and M. robertsii isolates, with an average of 8.2 g &plusmn; 4.38 g and 6 g &plusmn; 2 g harvested from the substrate, respectively.

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogenic fungi have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. In this study, the mass production of a sufficient number of resilient infective propagules of South African isolates of both Metarhizium robertsii and M. pinghaense for commercial application against insect pests was successfully conducted using agricultural grain products.

Produzione di massa di funghi entomopatogeni, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, per applicazioni commerciali contro gli insetti nocivi

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. The soil is a rich habitat for microorganisms, including EPF particularly belonging to the genera Metarhizium and Beauveria, which can regulate arthropod pests. Biological products based on fungi are available in the market mainly for agricultural arthropod pest control. Nevertheless, despite the high endemic biodiversity, only a few strains are used in commercial bioproducts worldwide. In the present study, 524 soil samples were cultured on potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium). The growth of fungal colonies was observed for 3 weeks. All Metarhizium and Beauveria EPF were morphologically identified at the genus level. Additionally, some isolates were molecularly identified at the species level. Twenty-four out of these 524 soil samples were also surveyed for EPF occurrence using the insect bait method (Galleria mellonella and Tenebrio molitor). A total of 51 EPF strains were isolated (41 Metarhizium spp. and 10 Beauveria spp.) from the 524 soil samples. All fungal strains were isolated either from croplands or grasslands. Of the 24 samples selected for comparison, 91.7% were positive for EPF using Galleria bait, 62.5% using Tenebrio bait, and 41.7% using CTC. Our results suggested that using insect baits to isolate the EPF from the soil is more efficient than using the CTC medium. The comparison of isolation methods in addition to the identification and conservation of EPF has a positive impact on the knowledge about biodiversity. The improvement of EPF collection supports scientific development and technological innovation.

Entomopathogenic fungal colonies are isolated from tropical soil samples using Tenebrio bait, Galleria bait, as well as selective artificial medium, i.e., potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium).

Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as any other vital resource, the fungi with which these plants intimately associate are essential for them. Hence, some of the most relevant techniques in studying mycoheterotrophic species are the ones that enable the investigation of associated fungi, especially those inhabiting roots and subterranean organs. In this context, techniques for identifying culture-dependent and culture-independent endophytic fungi are commonly applied. Isolating fungal endophytes provides a means for morphologically identifying them, analyzing their diversity, and maintaining inocula for applications in the symbiotic germination of orchid seeds. However, it is known that there is a large variety of non-culturable fungi inhabiting plant tissues. Thus, culture-independent molecular identification techniques offer a broader cover of species diversity and abundance. This article aims to provide the methodological support necessary for starting two investigation procedures: a culture-dependent and an independent one. Regarding the culture-dependent protocol, the processes of collecting and maintaining plant samples from collection sites to laboratory facilities are detailed, along with isolating filamentous fungi from subterranean and aerial organs of mycoheterotrophic plants, keeping a collection of isolates, morphologically characterizing hyphae by slide culture methodology, and molecular identification of fungi by total DNA extraction. Encompassing culture-independent methodologies, the detailed procedures include collecting plant samples for metagenomic analyses and total DNA extraction from achlorophyllous plant organs using a commercial kit. Finally, continuity protocols (e.g., polymerase chain reaction [PCR], sequencing) are also suggested for analyses, and techniques are presented here.

The current article aims to provide detailed and adequate protocols for the isolation of plant-associated endophytic fungi, long-term preservation of isolates, morphological characterization, and total DNA extraction for subsequent molecular identification and metagenomic analyses.

Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Biodosaggio ottimizzato per funghi entomopatogeni contro l'afide della senape

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, entomopathogenic fungi (EPF) are potential microbial control agents for controlling this pest. Therefore, virulence screening of EPF isolates under Petri dish conditions is necessary before field application. However, the mustard aphid is a parthenogenetic insect, making it difficult to record data during Petri dish experiments. A modified system for detached-leaf bioassays was developed to address this issue, using a micro-sprayer to inoculate conidia onto aphids and prevent drowning by facilitating air-drying after spore suspension. The system maintained high relative humidity throughout the observation period, and the leaf disc remained fresh for over ten days, allowing parthenogenetic reproduction of the aphids. To prevent offspring buildup, a process of daily removal using a painting brush was implemented. This protocol demonstrates a stable system for evaluating the virulence of EPF isolates against mustard aphids or other aphids, enabling the selection of potential isolates for aphid control.

Autore in primo piano: Gestione ecologica dei parassiti con funghi entomopatogeni contro gli afidi della senape 

This protocol presents an optimized detached-leaf bioassay system for evaluating the effectiveness of entomopathogenic fungi (EPF) against the mustard aphid (Lipaphis erysimi (Kalt.)), a parthenogenetic insect. The method outlines the data collection process during Petri dish experiments, enabling researchers to consistently measure the virulence of EPF against mustard aphids and other parthenogenetic insects.

Valutazione dell'effetto afididida di funghi entomopatogeni contro insetti partenogenetici, afide della senape, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

Stabilire funghi entomopatogeni come endofiti: Verso endofiti Controllo Biologico

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Sviluppo di

Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni

Isolamento e selezione di funghi entomopatogeni da campioni di suolo e valutazione della virulenza fungina contro gli insetti nocivi

Produzione di massa di funghi entomopatogeni, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, per applicazioni commerciali contro gli insetti nocivi

Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo

Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Valutazione dell'effetto afididida di funghi entomopatogeni contro insetti partenogenetici, afide della senape, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Valutazione dell'effetto afididida di funghi entomopatogeni contro insetti partenogenetici, afide della senape, Lipaphis erysimi (Kalt.)