Il protocollo descrive come registrare un profilo di mobilità ionica per i frammenti prodotti dall'attivazione di una molecola nello spettrometro di massa e come discriminare tra strutture isomeriche. Il protocollo consente di classificare i glicani in 11 gruppi per quanto riguarda alcune delle loro caratteristiche strutturali chiave, e quindi fornire un'informazione altrimenti difficile da ottenere. Può servire a costruire reti molecolari estremamente generiche e adatte a molte famiglie molecolari, come metaboliti o farmaci di interesse in molte aree di ricerca.
L'approccio sfrutta al meglio un nuovo concetto di spettrometria di mobilità ionica e sarà utile laddove la spettrometria di massa da sola non riuscirà a discriminare tra due strutture. L'esperimento richiede una buona padronanza della spettrometria di massa e della mobilità ionica. Tuttavia, lo sperimentatore dovrebbe avere successo nell'implementazione del metodo se si segue attentamente ciascuno dei passaggi.
A dimostrare la procedura sarà Simon Ollivier, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, impostare una sequenza IMS a passaggio singolo dalla pagina Tune, mettere lo strumento in modalità Mobility e aprire la finestra Cyclic Sequence Control. Selezionare Modalità avanzata dalla scheda Funzioni cicliche di questa nuova finestra, selezionare Aggiungi bundle, quindi Single/Multipass.
Attendere che una sequenza di eventi per dispositivi mobili venga visualizzata nella scheda Sequenza della stessa finestra. Adattare la sequenza in modo che tutti gli ioni calibranti facciano un singolo passaggio intorno alla pista IMS ciclica. Non modificare il tempo di iniezione o il tempo di espulsione e acquisizione, tuttavia, abbassare il tempo separato a un millisecondo.
Se alcuni ioni della miscela di calibrazione non rientrano nella finestra temporale di arrivo visualizzata, modificare la sincronizzazione dell'IMS con il pusher dell'analizzatore TOF di accelerazione ortogonale aumentando il numero di spinte per contenitore nella scheda Impostazioni ADC. Per registrare un'acquisizione di due minuti nella finestra Controllo sequenza ciclica, fare clic su Acquisisci per aprire la finestra popup Impostazioni acquisizione, immettere il nome file, la descrizione e la durata dell'acquisizione, minuti e fare clic su Salva. Passare lo strumento alla modalità TOF dalla pagina MS Tune per verificare la stabilità del segnale.
Registrare un'acquisizione completa del campione per un minuto, che sarà utile per verificare il pattern isotopico e la presenza di potenziali contaminanti. Metti lo strumento in modalità MSMS dalla scheda Profilo Quad/MS della pagina principale Tune. Selezionare la massa del ferro bersaglio nel campo di massa MSMS per l'isolamento nel quadrupolo.
Registrare un'acquisizione di un minuto per verificare l'isolamento del precursore durante l'elaborazione dei dati. Per eseguire una selezione basata sulla mobilità dell'isomero di interesse, passare lo strumento alla modalità Mobilità nella finestra Controllo sequenza ciclica, dalla scheda Funzioni cicliche selezionare Aggiungi bundle e quindi Slicing. Attendere che nella scheda Sequenza venga visualizzata una sequenza complessa di eventi per dispositivi mobili.
Posizionare l'evento Eject and Acquire subito dopo il primo evento Separato, quindi fare clic su Esegui. Cerca i risultati della separazione iniziale da visualizzare in tempo reale. Aumentare la durata del primo evento separato per una separazione multipass modificando il valore temporale per questo evento nella sequenza fino a quando la risoluzione dei picchi IMS non è soddisfacente.
Registrare un'acquisizione di un minuto come riferimento. Fate clic su Pausa (Pause), posizionate l'evento Eject and Acquire sotto gli eventi Eject, Eject to Pre-Store e Hold and Eject. Regolare la durata degli eventi in modo che il picco di destinazione si trovi nell'area Espelli in pre-archiviazione e qualsiasi altro ione si trovi nell'area Espelli o Blocca ed espelli.
Posizionate l'evento Eject and Acquire alla fine della sequenza sotto gli eventi Reinject from Pre-Store e i secondi eventi Separate. Fare clic su Esegui per visualizzare la popolazione selezionata. Controllare la qualità dell'isolamento.
Registrare un'acquisizione di un minuto come riferimento. Nella scheda Sequenza, nella colonna accanto agli orari degli eventi definiti dall'utente, cercare i tempi riepilogati di tutti gli eventi. Prendi nota del Time Abs trovato sulla linea dell'evento Reinject from Pre-Store per eseguire la calibrazione CCS.
Impostate la durata dell'evento Separate procedendo direttamente su Eject and Acquire su un millisecondo. Nella riga Reinject from Pre-Store selezionare la casella Abilita attivazione e ottimizzare la frammentazione con il controllo incorporato. Se la frammentazione non è soddisfacente con il controllo incorporato, deselezionare la casella Abilita attivazione e procedere all'ottimizzazione manuale delle tensioni di reiniezione, aumentare il gradiente pre-array e abbassare la tensione di offset dell'array fino a quando i risultati non sono soddisfacenti.
Per registrare un'acquisizione di due minuti nella finestra popup Acquisizione, selezionare l'opzione Mantieni tempo di deriva per generare un file contenente solo i tempi di arrivo, rispetto a M su Z etichettato come _dt.raw. Dopo aver eseguito l'analisi MS della miscela di pentasaccaride arabinoxilano, lo spettro ha mostrato un modello isotopico con un singolo picco a M su Z 685,24 suggerendo che i due composti sono di natura isomerica. Gli addotti dei pentasaccaridi sono stati separati attraverso la cella IMS ciclica e tre picchi sono stati separati con tempi di arrivo diversi.
L'XA3XX puro mostra i picchi a 83 e 90 millisecondi, mentre l'XA2XX mostra un picco a 94 millisecondi. Dopo il primo stadio di separazione IMS, gli ioni appartenenti a XA3XX sono stati espulsi e il picco a 94 millisecondi è stato selezionato per l'analisi IMS-IMS. Una separazione a tre passaggi è stata eseguita dopo aver reiniettato lo ione senza attivazione e un picco per XA2XX è stato ottenuto a 199 millisecondi.
I dati IMS-IMS MS generati sono stati de-convoluti utilizzando l'ora di arrivo e le dimensioni M su Z, generando gli spettri IMS-IMS. I picchi superiori allo 0,2% di intensità relativa sono stati esportati per la calibrazione CCS, risultando in uno spettro IMS-IMS calibrato CCS centroidato. È sempre importante controllare l'isolamento dello ione precursore, altrimenti lo spettro potrebbe provenire da una miscela del composto di interesse e dei contaminanti.
In precedenza abbiamo utilizzato spettri IMS-IMS per costruire reti e classificare composti, ma potrebbero anche essere utilizzati per cercare nei database le identificazioni dei composti. Questa tecnica è molto recente, ma ci aspettiamo che sarà estremamente utile in glicomica così come in qualsiasi contesto in cui gli analisti si confrontano con molecole isomeriche.
