Questa nuova tecnica combina la spettrometria di massa a mobilità ionica con la modellazione molecolare e la teoria della dinamica delle reazioni per determinare la termochimica relativa di due reazioni di dissociazione concorrenti di un complesso ternario. La combinazione di queste tecniche caratterizza i reagenti e le vie di reazione dei prodotti, le strutture conformazionali e l'affinità del ligando per formare un complesso ternario con lo ione metallico. Questa ricerca modella la reattività di due potenziali tag peptidici per la purificazione delle proteine ricombinanti, in cui il tag reagisce con il metallo chelato dall'acido nitrilotriacetico in una colonna di affinità metallica immobilizzata.
Iniziare caricando il campione da 2 millilitri in una siringa a naso smussato da 2,5 millilitri e iniettando il campione nell'elettrospray dello strumento utilizzando la pompa a siringa dello strumento a una portata di 10 microlitri al minuto. Posizionare lo strumento in modalità di mobilità ionica negativa o modalità IM-MS. Identificare il modello isotopico massa-carica del complesso ternario alternativo di legame del metallo caricato negativamente, o complesso amb-metallo-NTA, aprendo il programma di spettrometria di massa e selezionando Spettro.
Quindi, selezionare Strumenti (Tools), quindi Isotope Model (Isotope Model). Nella finestra popup, elenca la formula molecolare del complesso, seleziona la casella Mostra ione carico, inserisci 1 per la carica di uno negativo e fai clic su OK.In il modello isotopico visualizzato del complesso, nota il picco di massa più basso. Nel software dello strumento, selezionare Setup seguito da Quad Profile.
Quindi, selezionate Fisso manuale (Manual Fixed) e immettete la massa del picco del pattern isotopico più basso. Fare clic su Aggiorna e chiudere la finestra. Ancora una volta, selezionare Setup, quindi fare clic su Risoluzione quad.
Raccogli gli spettri IM-MS degli ioni negativi a partire dalla prima energia di collisione di trasferimento utilizzando una durata di esecuzione di 5 minuti e un tempo di scansione di 2 secondi. Ripeti per raccogliere gli spettri IM-MS per ciascuna delle altre energie di collisione. Utilizzare le distribuzioni integrate del tempo di arrivo, o aree ATD, per il complesso ternario amb-metallo-NTA e due prodotti, complesso NTA-metallo e complesso amb-metallo, per normalizzare a una scala percentuale relativa.
Dalla soglia di replica della dissociazione indotta dalla collisione, o misurazioni TCID, trova la media e le deviazioni standard di ciascun punto dati. Quindi, convertite l'energia di collisione di trasferimento del telaio di laboratorio nell'energia di collisione del centro di massa. Per misurare le sezioni trasversali di collisione, raccogliere gli spettri IM-MS dello ione negativo del campione di 10 ppm di poli-DL-alanina, o PA, per 10 minuti utilizzando le condizioni operative strumentali.
Quindi, raccogliere gli spettri IM-MS di ciascun complesso ternario per 5 minuti. Estrarre l'ATD di ciascuno dei complessi PA e ternari ed esportare i loro file nel software di spettrometria di massa utilizzando l'opzione Retain Drift Time. Trova i tempi medi di arrivo dai massimi delle curve ATD corrispondenti.
Utilizzare un metodo di calibrazione della sezione trasversale per convertire i tempi medi di arrivo in sezioni trasversali di collisione del complesso ternario. Dal menu principale di CRUNCH, apri il file di testo GB5 contenente l'energia del centro di massa o le intensità relative dipendenti dall'ECM dei prodotti. Risposta No ai parametri di lettura.
Quindi, selezionare Modellazione seguito da Imposta tutti i parametri. Dalle opzioni del modello di reazione, scegliere l'opzione predefinita Threshold CID seguita da RRKM con integrazione sulla distribuzione di trasferimento di energia del complesso ternario. Immettete 2 per i canali di prodotto indipendenti modellati e selezionate Calcola sezioni trasversali.
Per il tipo di modello non contorto, scegliere la sezione trasversale 0 Kelvin, che include la correzione statistica RRKM degli spostamenti cinetici dovuti alla finestra temporale di 50 microsecondi dalla cella di collisione al rilevatore del tempo di volo. Per le opzioni di convoluzione, scegliete il doppio integrale di Tiernan, che include la convoluzione sulle distribuzioni di energia traslazionale tra lo ione complesso ternario e il gas di collisione dell'argon. Per il metodo di integrazione numerica, scegliete Quadratura gaussiana con sezioni trasversali presalvate.
Dalle opzioni per l'inserimento dei parametri molecolari, immettere G per leggere il file di modellazione strutturale con le frequenze vibrazionali e rotazionali PM6 del complesso ternario. Risposta Sì alla domanda:Uno dei reagenti è atomico? Scrivere la posizione e il nome del file di modellazione.
Immettete 1 per la carica sullo ione e 1,664 per la polarizzabilità del gas argon. La massa dello ione e la massa del bersaglio sono rispettivamente per il complesso ternario e l'argon e vengono letti automaticamente dal file di testo GB5. Immettete 0 per le vibrazioni armoniche.
Premere Invio per leggere le costanti di rotazione 1D e 2D dal file di modellazione strutturale. Selezionare i valori di default 0 per i trattamenti del rotore ostacolato e 1 per la simmetria della molecola. Scegli il valore predefinito di 300 Kelvin per la temperatura del reagente.
Selezionare Integrazione per il metodo per la riduzione della densità della matrice di stati. Selezionare Sì per troncare la distribuzione dell'energia. Immettete il numero d'onda 40000 per l'energia massima per la distribuzione, il numero d'onda 2 per la dimensione del contenitore e 32 per il numero di punti nella distribuzione dell'energia.
Per i parametri per il modello TCID/RRKM, scegliere Sì per Modifica, immettere 0 per Tempo fisso e 0,000050 secondi per il limite superiore della finestra di rilevamento. Per il canale prodotto 1, selezionare 1 per un singolo stato di transizione dalle opzioni del canale di dissociazione e 0 per nessuna dissociazione sequenziale. Per il tipo di stato di transizione, scegliete 1 per l'orbita.
Selezionare G per leggere i file di programma di modellazione che contengono i parametri rotazionali e vibrazionali PM6 per il complesso amb-metal più i prodotti NTA. Inserisci No per:Uno degli stati di transizione limite dello spazio delle fasi, o PSL TS, è atomico? Immettere la posizione e il nome del file complesso amb-metal.
Usa 1.062 per le frequenze di scala, premi Invio per il numero di atomi e inserisci No per:La molecola è lineare? Ripetete lo stesso per il file di modellazione che contiene le frequenze vibrazionali e rotazionali del prodotto NTA. Immettere la descrizione del TS orbitante. Immettete 1.0 per la carica dello ione amb-metallo, quindi inserite la polarizzabilità e il momento di dipolo di NTA.
Selezionare 0 Kelvin per la temperatura di rotazione e il dipolo bloccato per il trattamento dello stato di transizione orbitale. Inserisci le masse medie dello ione amb-metallo e NTA. Premere Invio per leggere le costanti di rotazione 1D e 2D dai file di modellazione.
Selezionare 0 per i rotori ostacolati, 1 per la simmetria molecolare e 1 per la degenerazione di reazione. Immettere l'opzione Nessuna modifica. Per il canale prodotto 2, selezionare 1 per il singolo stato di transizione, 0 per nessuno per la dissociazione sequenziale e 1 per l'orbita per il tipo di stato di transizione.
Selezionare G per leggere i file di modellazione che contengono i parametri rotazionali e vibrazionali PM6 per il complesso NTA-metallo e i prodotti amb. Quindi, inserisci la descrizione della TS orbitante. Immettete 1.0 per la carica dello ione complesso NTA-metallo, e inserite la polarizzabilità e il momento di dipolo dell'amb. Selezionare 0 Kelvin per la temperatura di rotazione e locked-dipole per il trattamento dello stato di transizione orbitale.
Inserisci le masse medie del complesso NTA-metallo e dei prodotti amb. Premere Invio per leggere le costanti di rotazione 1D e 2D dai file di modellazione. Selezionare 0 per i rotori ostacolati, 1 per la simmetria molecolare e 1 per la degenerazione di reazione.
Quindi, immettere Nessuna modifica. Per gestire le rotazioni 2D inattive, selezionare le opzioni di default per la distribuzione statistica del momento angolare e integrare la distribuzione P-E, G su J. Utilizzare il valore predefinito 32 nel numero di punti nell'integrazione.
Per il menu Modello, selezionate Ottimizza parametri per adattare i dati e immettete rispettivamente l'energia minima e l'energia massima per iniziare e terminare l'adattamento dei dati. Selezionare 1 per le deviazioni standard sperimentali dei modelli di ponderazione. In base ai dati, selezionare una deviazione standard minima accettabile compresa in genere da 0,01 a 0,001.
Utilizzare il valore di default per il limite di convergenza E0 e selezionare No per mantenere qualsiasi parametro al valore corrente, 0,5 e 2,0 elettronvolt per i limiti inferiore e superiore e 2 per il metodo di valutazione derivata. Dal menu Ottimizzazione, selezionare Inizia ottimizzazione. Il programma CRUNCH ottimizzerà il modello TCID selezionato in base ai dati sperimentali.
Infine, nel menu Modello, selezionare delta-H e S a T per la valutazione termochimica dei due canali di dissociazione. L'immagine rappresentativa mostra le strutture primarie dei peptidi A e H che legano metalli alternativi. Il colore evidenzia i potenziali siti di legatura del metallo.
La dipendenza energetica per la formazione degli ioni prodotto amb-metallo e NTA-metallo è mostrata qui. L'energia di collisione del centro di massa, dove c'è il 50% di dissociazione del complesso ternario amb-metallo-NTA, è inclusa nei grafici. Le immagini rappresentative mostrano il modello dinamico per il metodo TCID risolto energeticamente.
Le collisioni tra il complesso ambH-zinco-NTA più l'argon provocano la dissociazione al complesso ambH-zinco e NTA libero, o complesso NTA-zinco e prodotti ambH liberi. Le energie di soglia E1 ed E2 equivalgono alle entalpie 0 Kelvin di dissociazione per le reazioni ambH-zinco-NTA complesso ambH-zinco e NTA libero, o ambH-zinco-NTA complesso NTA-zinco e ambH libero, rispettivamente. I complessi ternari amb-metallo-NTA PM6 ottimizzati per la geometria di A e H sono mostrati qui.
Questi conformatori sono stati utilizzati nella modellazione TCID dei dati sperimentali e sono stati selezionati da altre strutture candidate confrontando le loro energie elettroniche PM6 e il modo in cui le loro sezioni trasversali di collisione calcolate rispetto alle sezioni trasversali di collisione misurate dall'IM-MS. Il TCID risolto in energia dei quattro complessi amb-metallo-NTA è raffigurato in queste immagini. Per le specie A e H, gli ioni prodotto di amb-metallo e NTA-metallo con i contorti CRUNCH threshold fits sono mostrati qui.
I valori energetici sono le entalpie di dissociazione a 0 Kelvin per le reazioni amb-metal-NTA ad amb-metal e NTA libero, o amb-metaL-NTA a NTA-metallo e amb libero. Un confronto tra le energie libere di associazione di Gibbs in kilojoule per mole e le costanti di formazione derivate dalle entalpie di dissociazione, Kelvin netto zero, con calcoli di meccanica statica utilizzando i parametri PM6 sono mostrati qui. La reazione di NTA-nichel e ambA libero per formare il complesso ambA-nichel-NTA mostra la più alta costante di formazione e rappresenta la reazione in cui la proteina ambA-marcata viene immobilizzata dal NTA-nichel all'interno della colonna di affinità.
Il crunch fitting richiede un attento screening dei reagenti e dei prodotti per ottenere energie di soglia accurate. È richiesta esperienza nella modellazione molecolare per ottenere le strutture e parametri molecolari affidabili. I metodi generali qui descritti potrebbero essere sviluppati per lo screening dell'efficacia di molecole progettate per legare cofattori metallici e siti attivi di proteine per bloccare le funzioni enzimatiche.
