Il protocollo descrive un approccio semplificato per lo screening e l'isolamento di microbi resistenti ai metalli pesanti da sorgenti geotermiche. Questo approccio rappresenta un'area di ricerca di crescente interesse a livello mondiale per l'applicazione nel campo del biorilevamento e del biorisanamento. Il metodo ivi descritto può essere facilmente modificato per isolare i microbi da diverse fonti ambientali come acqua, cibo, suolo o sedimenti.
La concentrazione minima inibitoria per identificare un microbi resistente è una strategia rapida per caratterizzare le nuove specie o ceppi. Questo protocollo è facile da eseguire e richiede solo abilità manuale ed esperienza con le tecniche di microbiologia di base. Per iniziare, inoculare due grammi di campione raccolto in 50 microliti di terreno Luria-Bertani appena preparato con un pH di quattro o sette.
Incubare questo campione alla temperatura del sito di campionamento più o meno cinque gradi Celsius. Piastra 200 microlitri del campione su Agar Luria-Bertani con un pH di quattro o sette e mantenerlo in condizioni statiche a 55 o 60 gradi Celsius per 48 ore. Dopo l'incubazione, isolare le singole colonie e ripetere questo ciclo di placcatura delle striature almeno tre volte.
Per preparare un millilitro di brodo cellulare congelato, aggiungere il 20% di glicerolo alle cellule coltivate durante la notte. Utilizzare una miscela di acetone e ghiaccio secco per un congelamento rapido. Per preparare un inoculo da un brodo di glicerolo, inoculare 50 microlitri in 50 millilitri di Luria-Bertani.
Per ottenere un profilo di crescita, diluire questa precoltura in 10 microlitri di Luria-Bertani. Per regolare la densità ottica a 0,1 aggiungere 600 nanometri. Far crescere queste cellule per 16 ore a 55 o 60 gradi Celsius nello shaker orbitale.
Misurare la densità ottica a 600 nanometri a intervalli di 30 minuti. Curva da questi dati con il tempo sull'asse X e la densità ottica a 600 nanometri sull'asse Y. Tracciare curve di crescita simili con pH variabile del terreno di coltura, per determinare il pH ottimale per le condizioni di laboratorio, inoculare l'isolato striato dal brodo di glicerolo in 50 microlitri del mezzo Luria-Bertani e incubare durante la notte.
Centrifuga questa coltura coltivata durante la notte per 10 minuti a 5.000 volte G, quindi scarta il surnatante e raccogli la tavolozza di coltura. Preparare 10 millilitri di tampone di lisi batterica composto da 20 tris-HCL millimolari, due EDTA millimolari, 1,2% Triton X-100 e 20 milligrammi per millilitro lisosoma immediatamente prima dell'uso. Sospendere nuovamente il pellet in 180 microlitri di tampone di batterilisi.
Estrazione del DNA genomico come indicato nel kit di purificazione e misura del DNA genomico e della sua purezza mediante UV-Vis. Per valutare la purezza, determinare i rapporti di densità ottica da 260 a 280 e da 260 a 230. Valutare l'integrità del DNA genomico caricando 200 nanogrammi di ciascun campione su un gel di agarosio allo 0,8% e confrontando la distribuzione dimensionale con un marcatore molecolare di altezza e peso.
Coltiva l'isolato dallo stock di glicerolo in 200 millilitri di condizioni ottimali di pH e temperatura di Luria-Bertani. Diluire ogni precoltura in cinque millilitri di terreno Luria-Bertani in 50 millilitri di tubi di polipropilene contenenti concentrazioni crescenti di metalli pesanti e antibiotici per ottenere una densità ottica di 0,1 a 600 nanometri. Far crescere le cellule per 16 ore su uno shaker orbitale con 180 giri al minuto a 55 o 60 gradi Celsius.
Calcolare la concentrazione minima inibitoria per antibiotici o metalli pesanti identificando i valori di concentrazione nei tubi in cui non si verifica la crescita microbica. Verificare che la concentrazione sia inibitoria e non letale per le cellule placcando 200 microlitri della coltura coltivata a concentrazioni minime inibitorie su piastre di agar Luria-Bertani e verificando la presenza di colonie dopo incubazione notturna. Questo protocollo è stato utilizzato per testare campioni batterici provenienti dall'area di Piscarelli, un ambiente geotermico solforico acido La caratterizzazione fenotipica dei microrganismi isolati ha dimostrato che l'isolato ha una maggiore tolleranza all'arseniato e al vanadato ed è resistente al cadmio.
Dati comparativi suggeriscono che l'isolato uno ha una forte resistenza all'arsenico pentavalente mentre l'isolato due ha resistenza all'arsenico trivalente. I test di resistenza agli antibiotici hanno dimostrato che isolare uno è altamente sensibile a tutti gli antibiotici testati anche quando sono state utilizzate basse concentrazioni. Al contrario, l'isolato due è resistente a tutti gli antibiotici testati ad eccezione del cloramfenicolo e della tetraciclina.
Il microrganismo probabilmente ha acquisito resistenza agli antibiotici a causa di mutazioni casuali o trasferimento genico orizzontale che rappresenta un vantaggio selettivo in condizioni ambientali estreme. Questo studio dimostra l'utilità di tali metodi per selezionare microrganismi ambientali in grado di inattivare gli inquinanti e convertirli in prodotti innocui.
