Lo scopo di questo video è quello di descrivere un modello di coltura di organi corneali umani di Descemet's Stripping Only con guarigione accelerata, stimolata dal fattore di crescita ingegnerizzato dei fibroblasti uno. La distrofia corneale endoteliale di Fuch, o FECD, è una malattia caratterizzata dalla perdita della funzione della pompa nelle cellule endoteliali corneali e dall'eccessivo accumulo di collagene e altre proteine della matrice extracellulare sulla superficie della membrana di Descemet, formando gutte corneali. L'unico trattamento noto per la FECD è la cheratoplastica endoteliale in varie forme, tutte a rischio di rigetto e perdita di cellule endoteliali.
Mentre i progressi nella chirurgia oftalmica hanno permesso a queste procedure di diventare meno invasive nel tempo, qualsiasi forma di trapianto comporta il rischio di rigetto e la possibilità di uso di steroidi a vita. Descemet's Stripping Only, o DSO, è un'alternativa sperimentale in cui i pazienti con FECD con guttae localizzate al centro della cornea hanno il cerchio centrale di quattro millimetri della membrana di Descemet rimosso senza sostituzione dell'innesto. La rimozione delle guttae incoraggia le cellule periferiche sane a migrare verso l'interno e a riformare il monostrato endoteliale, invertendo infine l'edema stromale e migliorando la visione.
Sebbene ci siano molti vantaggi in questo metodo, il processo di guarigione è lungo e incoerente e alcuni pazienti richiedono un trapianto di salvataggio se non si vede alcuna guarigione nel mese successivo all'intervento chirurgico. Un trattamento che stimola la guarigione più rapida delle ferite dopo DSO, può rendere la procedura un'opzione più fattibile per i pazienti con FECD. Questo protocollo modella la procedura clinica DSO in un formato di coltura di organi utilizzando cornee di donatori umani, con l'obiettivo di testare trattamenti per migliorare la guarigione delle ferite dopo DSO, per rendere DSO un'opzione più fattibile per i pazienti con FECD.
Il nostro laboratorio utilizza questo modello per testare la guarigione delle ferite nelle cornee trattate con un fattore di crescita dei fibroblasti ingegnerizzato per il quale mostreremo risultati rappresentativi più avanti in questo video. In questa parte della procedura, verrà utilizzato un pugno bioptico per contrassegnare l'area della ferita di quattro millimetri da cui verrà rimossa la membrana di Descemet. Utilizzando una pinza sterile, rimuovere la cornea dal supporto e risciacquare in 1X PBS per rimuovere i residui e i detriti cellulari.
Dopo il risciacquo, posizionare il lato endoteliale della cornea sul coperchio di una capsula di Petri. Immergere un nuovo punzone bioptico di quattro millimetri in blu tripano in un piatto di saldatura e toccare l'eccesso. Usando entrambe le mani posizionare il pugno sopra il centro della cornea e abbassarlo direttamente sulla superficie endoteliale, applicando una pressione minima.
Senza cambiare la posizione o la pressione sulla cornea, spostare il pugno su una mano e raggiungere la pinza con la mano appena libera. Utilizzare la pinza per tenere la cornea in posizione mentre si torce delicatamente il pugno della biopsia di circa 90 gradi avanti e indietro più volte. Sollevare il pugno della biopsia direttamente dalla cornea e mettere da parte.
Risciacquare ancora una volta in 1X PBS per rimuovere l'eccesso di tripano blu. Trasferire la cornea sul coperchio della capsula di Petri in un ambito di dissezione. Tenendo la cornea in posizione con una pinza curva, segna la membrana di Descemet trascinando leggermente la punta di un ago affilato di calibro 30 lungo l'anello di tripano blu lasciato dal pugno della biopsia.
Utilizzare una pressione minima per evitare di interrompere lo stroma sottostante. Con un gancio sinskey usa delicati movimenti di scooping per sollevare e staccare la membrana di Descemet attorno al bordo della ferita. Lavorare verso il centro della lesione.
La membrana di Descemet dovrebbe avere pochissima resistenza. Se stai riscontrando difficoltà, probabilmente stai tirando su lo stroma. Se ciò accade, ricominciare, sollevando da un nuovo punto lungo il bordo della ferita.
Una volta che la maggior parte della membrana di Descemet è stata separata dallo stroma, utilizzare una pinza di Gorovoy per rimuovere la membrana e metterla da parte. Esaminare l'area spogliata per eventuali pezzi rimanenti di membrana e rimuovere con pinza Gorovoy. Dopo la colorazione di Descemet, la cornea con tripano blu per visualizzare l'area della ferita.
Risciacquare la cornea in 1X PBS contenente lo 0,01% di cloruro di calcio e cloruro di magnesio per rimuovere i detriti cellulari che potrebbero interagire con il tripano blu e facilitare la stretta aderenza dei restanti CEC alla membrana intatta di Descemet. Posizionare la cornea in un piatto saldato e pipettare 30 microlitri di tripano blu sullo strato endoteliale per 30 secondi. Utilizzare una pinza per scuotere delicatamente la cornea per garantire che l'intera superficie endoteliale sia coperta.
Risciacquare l'eccesso di tripano blu in PDS con calcio e magnesio e visualizzare la cornea colorata sotto un microscopio di dissezione per il punto zero del giorno. Dopo aver completato questa procedura, le cornee di coltura in una piastra a sei pozzetti contenente un basso mezzo sierico costituito dai seguenti componenti elencati. Coltivare la cornea sinistra in otto mulini di soli mezzi sierici bassi e la cornea destra in mezzi sierici bassi integrati con FGF-1 ingegnerizzato o altri trattamenti di prova desiderati.
Incubare le cornee a 37 gradi Celsius con il 6% di CO2 per 14 giorni con cambiamenti giornalieri dei media. Ripetere la procedura di colorazione del tripano nei giorni, tre, sei, nove, 12 e 14 e visualizzare ogni cornea immediatamente dopo la colorazione. Assicurati di mantenere le impostazioni della fotocamera coerenti su tutti i punti temporali.
Dopo il periodo di coltura possono essere eseguite ulteriori macchie sulle cornee in base agli interessi di ricerca, in particolare per l'esperimento. Ulteriori macchie rilevanti per gli interessi di ricerca del nostro laboratorio includono la colorazione di Alizarin, così come la colorazione fluorescente per l'incorporazione EDU e le proteine a giunzione stretta ZO-1. La colorazione dell'alizarina viene eseguita per visualizzare i bordi cellulari per confermare i risultati della colorazione del tripano e visualizzare la morfologia cellulare nell'area guarita.
La colorazione immunofluorescente ZO-1 consente la visualizzazione della formazione di giunzioni strette tra i CEC, che è di particolare interesse all'interno e intorno all'area guarita. L'etichettatura EdU viene eseguita come misura qualitativa per confermare che la proliferazione contribuisce alla guarigione e può anche essere utilizzata per quantificare le cellule proliferanti in alcuni contesti. Istruzioni più dettagliate su come eseguire queste specifiche procedure di colorazione sono incluse nell'articolo corrispondente a questo video.
Ecco le immagini rappresentative di un paio di cornee giudicate distrofiche dalla Eye-Bank che sono state incubate con o senza l'FGF-1 ingegnerizzato per un periodo di 14 giorni. Come si vede nelle immagini, la cornea trattata con FGF-1 ingegnerizzata ha dimostrato una guarigione accelerata rispetto alla cornea di controllo non trattata. Un'ulteriore colorazione di Alizarin alla fine del periodo di coltura, servì a delineare i confini cellulari e confermata con questi risultati.
Questa osservazione è stata replicata su 11 paia di cornee distrofiche per convalidare il modello in un campione di cornea più rilevante per la procedura clinica DSO. Il software di elaborazione delle immagini, come ImageJ, può essere utilizzato per misurare l'area macchiata in queste immagini per quantificare i progressi della guarigione delle ferite, come si può vedere qui. Tutte le cornee distrofiche trattate con FGF-1 ingegnerizzato hanno mostrato una maggiore guarigione al giorno 14, rispetto al compagno non trattato, con conseguente guarigione media del 91% rispetto al 38% nelle cornee di controllo.
E questa differenza era statisticamente significativa. Ulteriori immunoistochimici visualizzate mediante imaging confocale hanno rivelato un'espressione semi-organizzata della proteina a giunzione stretta ZO-1, riflettendo i precedenti modelli di colorazione dell'alizarina. L'etichettatura EDU ha confermato la presenza di cellule proliferanti all'interno e intorno all'area della ferita ed è stata visibile a livelli più elevati nelle cornee trattate rispetto ai controlli non trattati.
In alcune coppie di cornea, la morte della CEC può essere visibile periferica all'area della ferita, in particolare nelle cornee distrofiche. Ecco alcune immagini di esempi di cornee macchiate di tripano che mostrano una sostanziale morte delle cellule periferiche. Come si vede nelle immagini, la morte delle cellule periferiche si verifica principalmente in punti temporali precedenti e gradualmente si inverte nel corso del periodo di coltura.
Questa colorazione periferica può complicare la quantificazione dell'area della ferita quando si collega alla ferita in quanto può essere difficile accertare la posizione del bordo dell'area della ferita. Tuttavia, in tutti i casi, la colorazione periferica del trippan è stata eliminata abbastanza da produrre immagini misurabili all'ultimo giorno 14 time point. Riteniamo che questo fenomeno sia unico per le cornee da donatore coltivate ex vivo e non sia rilevante per le cornee umane in vivo.
Poiché il danno all'endotelio periferico non è stato riportato in alcun caso clinico di studio di DSO a nostra conoscenza. Un secondo modello di colorazione indicato come colorazione periferica è stato catturato nelle immagini alizarina rossa, ma è stato anche evidente nelle immagini blu tripano per tutto il periodo della cultura. Questa osservazione è caratterizzata da un anello di colorazione scura intorno al limbus che indica un endotelio compromesso.
Nonostante il termine, questo modello era così comune sia nelle cornee normali che in quelle distrofiche che non venivano conteggiate come positive per la colorazione periferica. Questo protocollo ci ha permesso di dimostrare risultati di guarigione migliorati nelle cornee coltivate trattate con FGF-1 ingegnerizzato dopo lo stripping di Descemet. Inoltre, questo protocollo di stripping funge da metodo prezioso per altri ricercatori che studiano DSO e può essere utilizzato per un'ampia varietà di applicazioni, tra cui il test di altre terapie di guarigione delle ferite, la valutazione delle modifiche alla tecnica chirurgica e il confronto della guarigione tra diverse popolazioni di donatori o stadi di malattia.
Speriamo che questa ricerca e altre ricerche che utilizzano questo protocollo incoraggino i medici a considerare DSO come una preziosa opzione di trattamento per i loro pazienti FECD idonei in futuro.
