Questo protocollo è significativo perché è un ottimo modello per studiare l'infiammazione corneale e il suo contributo alla guarigione delle ferite in condizioni normali e patologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea una ferita epiteliale precisa e riproducibile senza rompere la membrana basale. Questo modello di ferita corneale è semplice e veloce da eseguire.
A dimostrare la procedura sarà il principe Akowuah, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione di fluoresceina all'1% sciogliendo 10 milligrammi di sale di fluoresceina di sodio in un millilitro di soluzione salina sterile o PBS. Successivamente, per l'anestesia, preparare 10 millilitri di un cocktail ketamina-xilazina mescolando due millilitri di ketamina, un millilitro di xilazina e sette millilitri di PBS sterile.
Dopo aver anestetizzato un topo C57 black 6 wild-type di 8-12 settimane, valuta la profondità dell'anestesia valutando il riflesso del pedale dopo il pizzicamento delle dita dei piedi. Per creare la ferita corneale epiteliale, posizionare il topo anestetizzato sotto un microscopio di dissezione. Ferire solo l'occhio destro o sinistro e mantenere la coerenza con l'occhio ferito quando si passa dal mouse al mouse.
Tenere l'occhio spalancato tenendo le palpebre con il pollice e l'indice. Quindi, usando una trefina sterile di due millimetri di diametro, delimitare il centro della cornea e far roteare delicatamente la trefina per fare un'impressione sull'epitelio corneale. Non applicare una pressione eccessiva, in quanto ciò può causare perforazione corneale.
Successivamente, tenendo lo spud sterile smussato della mazza da golf con un angolo di circa 45 gradi dalla superficie della cornea, sbrigliare l'epitelio raschiando attentamente e continuamente all'interno dell'area delimitata utilizzando lo spud. Non applicare una forza eccessiva e mantenere l'idratazione utilizzando PBS sterile, se necessario. Per il monitoraggio della chiusura e della riepitelizzazione della ferita, pipettare da 1 a 1,5 microlitri di soluzione di fluoresceina all'1% sulla superficie ferita e visualizzare la cornea utilizzando un microscopio digitale con una sorgente di luce blu.
Immagina la cornea ferita in momenti specifici dopo la ferita. Scatta immagini entro il primo minuto di aggiunta di soluzione di fluoresceina per evitare la diffusione della soluzione all'epitelio circostante, che può portare a una sovrastima delle dimensioni della ferita. Successivamente, utilizzando un software di analisi delle immagini, tracciare l'area della ferita ed esprimere l'area della ferita in ogni punto temporale come percentuale dell'area della ferita originale all'ora zero.
Una micrografia elettronica a trasmissione della ferita corneale dimostra che la membrana basale dell'epitelio rimane intatta anche dopo la lesione. Nei topi selvatici di 8-12 settimane, la chiusura della ferita è completa 24 ore dopo la ferita. La risposta infiammatoria alla ferita è caratterizzata dall'imaging cellulare al limbus.
Qui è mostrata la vascolarizzazione limbare di una cornea non avvolta con neutrofili extra-vascolari e quella di una cornea ferita con piastrine extravascolari e neutrofili 30 ore dopo l'abrasione. Per riprodurre correttamente questo protocollo, è necessario utilizzare lo stesso ceppo in ogni intervallo di mouse e le dimensioni e la profondità della ferita devono essere create come descritto.
