Questo protocollo offre un metodo di somministrazione della terapia genica a più tessuti oculari in modo sicuro, facile ed efficace. È anche adattabile per iniezioni intrastromali e sottoretiniche in piccoli animali. L'uso della via di iniezione subcongiuntivale è minimamente invasivo.
Pone meno rischi e rappresenta una grande promessa per la somministrazione AV per il trattamento di più malattie oculari. Con oltre 1 miliardo di persone in tutto il mondo che soffrono di disabilità visive, l'utilizzo di un metodo sicuro e semplice per la somministrazione di farmaci offre un'ampia applicabilità per il trattamento di molte diverse cause di cecità. I metodi di consegna genica descritti in questo protocollo sono di particolare interesse per coloro che stanno sviluppando potenziali strategie di intervento e praticando oftalmologi, che alla fine consegneranno questi farmaci ai pazienti.
La sfida più grande per qualcuno che sta eseguendo questo protocollo per la prima volta è probabilmente l'inserimento dell'ago nello spazio congiuntivale concettuale. Per iniziare, assemblare il sistema di iniezione posizionando uno stereomicroscopio e una pompa a siringa in un armadio di biosicurezza. Quindi, tagliare il tubo di polietilene ad una lunghezza di circa 50 centimetri.
Inserire l'estremità di un ago calibro 36 in un'estremità del tubo. Quindi riempire una siringa monouso da 3 millilitri con acqua sterile e inserirla nel lato del tubo opposto all'ago. Lavare il tubo tre volte, alternando acqua sterile e alcool al 70% per disinfettare il tubo e assicurarsi che non vi siano perdite, intasamenti o danni in tutto il tubo.
Utilizzando la siringa monouso da 3 millilitri, riempire il tubo con acqua sterile e lasciare il tubo attaccato alla siringa monouso. Quindi posizionare un pezzo di paraschiuma sulla superficie dell'armadio di bio-sicurezza e aggiungere una pozza di acqua sterile ad esso. Immergere la porzione del tubo collegato all'ago nella piscina di acqua sterile.
Quindi, estrarre la siringa monouso dall'apertura del tubo per evitare che l'aria entri nel sistema di tubi dopo la rimozione della siringa. Quindi riempire una siringa Hamilton da 10 microlitri con acqua sterile. Quindi, collegare l'ago della siringa di Hamilton all'estremità aperta del tubo immergendo la punta dell'ago della siringa di Hamilton nella pozza di acqua sterile sul film parapara.
Tenere premuto il pulsante di inversione rapida sullo schermo della pompa per spostare i blocchi di spinta alla lunghezza approssimativa della siringa. Quindi, svitare le manopole di serraggio della staffa per allentare le staffe di fissaggio sullo spintore e sui blocchi del supporto della siringa. Successivamente, caricare la siringa Hamilton sul blocco portasiringa e fissare la siringa seguendo le istruzioni del produttore.
Per regolare i parametri nella schermata di impostazione della pompa, premere il pulsante "Forza" e impostare il livello di forza su 30%Quindi accettare le modifiche per tornare alla schermata di impostazione. Premere il pulsante "Quick Start", selezionare Metodo, quindi selezionare l'opzione "Solo infusione". Per l'opzione siringa, selezionare Hamilton 1700, quindi fare clic su "Vetro" e selezionare 10 microlitri.
Successivamente, selezionare la velocità di infusione e il volume di iniezione. Espellere l'acqua dalla siringa di Hamilton lasciando il tubo e l'ago per iniezione pieni d'acqua premendo il pulsante "Infuse". Quindi, prelevare il virus inserendo l'ago per iniezione in un'aliquota dello stock virale.
Quindi tirare leggermente indietro la siringa di Hamilton premendo il pulsante inverso per introdurre una piccola bolla d'aria nel tubo. Dopo aver anestetizzato l'animale, afferra la congiuntiva con una pinza. Quindi inserire l'ago nella congiuntiva fino a quando la smussatura è interamente coperta dalla membrana congiuntivale e appoggiare l'ago contro il globo.
Contemporaneamente, iniziare l'iniezione premendo il pulsante "Start" utilizzando l'interruttore a pedale. Per esaminare la distribuzione del vettore AAV, i tessuti oculari e circostanti sono stati colorati con ematossilina ed eosina. Le sezioni sagittali rappresentative hanno dimostrato che la dispersione dell'inchiostro indiano si è verificata principalmente adiacente ai muscoli extraoculari nella superficie esterna della sclera nei tessuti connettivi sciolti perioculari.
Per confermare la trasduzione dell'AAV 8 auto-complementare a otto settimane dopo l'iniezione, l'abbondanza di proteine a fluorescenza verde nelle sezioni trasversali è stata esaminata mediante colorazione con immunofluorescenza. I risultati hanno rivelato che i vettori AAV 8 trasducevano efficacemente i muscoli perioculari posteriori all'occhio e alla cornea. Per analizzare la biodistribuzione del vettore, i numeri di copie del genoma vettoriale e i compartimenti oculari distinti in altri organi, tra cui fegato e cuore, sono stati esaminati mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa utilizzando primer e sonde specifici per il transgene.
L'espressione del transgene è stata confermata dalla reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa, che ha suggerito che l'iniezione subcongiuntivale di AAV 8 provoca l'espressione di transgeni nella palpebra, nella congiuntiva, nella cornea e nel nervo ottico. La bolla d'aria fungerà da barriera tra l'acqua nel tubo e il farmaco terapeutico. Questa tecnica consente ad altri ricercatori di esplorare l'uso della via di somministrazione subcongiuntivale sia per le soluzioni oftalmiche che per le terapie geniche oculari per più malattie.
