Il nostro laboratorio studia i cambiamenti metabolici nella retina e in tutto il sistema nervoso centrale che si verificano con l'età e nelle malattie neurodegenerative. Il nostro obiettivo principale è quello di sfruttare questi risultati per identificare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento delle malattie neurodegenerative legate all'età. Rilevare l'assorbimento del glucosio nel tessuto retinico è spesso costoso e richiede tempo, nonché complicate modalità di imaging o persino sostanze radioattive.
Abbiamo stabilito questo protocollo per fornire una nuova tecnica ex vivo per misurare l'assorbimento dell'analogo del glucosio fluorescente nei campioni di retina. Il protocollo che abbiamo sviluppato fornisce una strategia semplice ed economica per misurare l'assorbimento ex vivo di analoghi fluorescenti del glucosio nell'intera retina intatta. Questo metodo è anche vantaggioso in quanto consente ai ricercatori di misurare più campioni contemporaneamente.
Questo protocollo consentirà ai ricercatori di valutare i cambiamenti nell'assorbimento retinico degli analoghi fluorescenti del glucosio, il che ci aiuterà a capire meglio come la retina utilizza il glucosio come substrato energetico sia con l'età che in stati di salute e malattia. Per iniziare, preparare una soluzione madre di cinque millimolari di 6-NBDG in una miscela di DMSO al 50% e PBS. Conservare 500 microlitri di aliquote della soluzione a meno 20 gradi Celsius.
Mettere sul ghiaccio una provetta conica da 50 millilitri contenente Neurobasal-A Medium senza glucosio. Etichettare le provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri come carenza di glucosio, incubazione 6-NBDG, sonicazione e raccolta del campione per il test di perforazione. Aggiungere 100 microlitri di Neurobasal-A Medium raffreddato alle provette di sonicazione pre-marcate su ghiaccio.
Accendere il lettore di piastre. Impostazione dei parametri della piastra nel software del lettore di piastre utilizzando la funzione del saggio del punto finale di fluorescenza con eccitazione impostata su 483 nanometri, emissione impostata su 550 nanometri e cutoff impostato su 530 nanometri. Diluire la soluzione madre di cinque millimolari di sei NBDG in Neurobasal-A Media per preparare una soluzione di lavoro da 500 micromolari e coprirla con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
Pipettare 200 microlitri della soluzione di lavoro nelle provette di incubazione 6-NBDG pre-marcate e coprire come dimostrato. Dopo aver isolato la retina da un topo soppresso utilizzando una pipetta di trasferimento tagliata o una pinzetta, trasferire la retina in una provetta da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di terreno Neurobasal-A per la carenza di glucosio. Incubare la provetta in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Trasferire la retina in una provetta pre-marcata contenente 200 microlitri di 6-NBDG 500 micromolari in Neurobasal-A Medium. Incubare la provetta in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Per preparare gli standard 6-NBDG, etichettare otto provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri come standard da uno a otto.
Per quello standard, pipettare 32 microlitri di soluzione madre 6-NBDG da 500 micromolari nella provetta etichettata. Quindi aggiungere 368 microlitri di Neurobasal-A Medium alla provetta e mescolare accuratamente pipettando su e giù. Coprire tutti i tubi con un foglio di alluminio.
Dopo 60 minuti di incubazione a 6 °C., rimuovere i tubi dal bagnomaria a 37 gradi Celsius. Per lavare la retina, rimuovere la soluzione di 6-NBDG utilizzando una pipetta senza disturbare il tessuto retinico e aggiungere 500 microlitri di Neurobasal-A Medium ghiacciato fresco su ghiaccio. Quindi, usando una pinza, trasferire con cura la retina nei tubi di sonicazione contenenti Neurobasal-A Medium su ghiaccio.
Usando piccole forbici da dissezione, taglia la retina in piccoli pezzi. Sonicare ogni retina per cinque-10 secondi a un'ampiezza di 10 e riposizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Centrifugare i campioni a 21, 130 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire 100 microlitri di surnatante in una piastra a 96 pozzetti. Inserire la piastra nel lettore di piastre. Selezionare il saggio del punto finale di fluorescenza con le lunghezze d'onda specificate.
Esegui il test e salva i risultati. Dopo la seduta, pipettare i campioni dalla piastra a 96 pozzetti in provette pre-marcate per il saggio di perforazione. Utilizzando gli standard proteici del saggio di perforazione prediluiti, aggiungere 10 microlitri di ciascuno standard in duplicato in una piastra inferiore trasparente a 96 pozzetti.
Quindi trasferire 10 microlitri di campione nella piastra. Aggiungere 150 microlitri di reagente pierce a tutti i pozzetti contenenti standard o campioni. Coprite il piatto e mescolate su uno shaker a media velocità per un minuto.
Incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti. Inserire la piastra nel lettore di piastre e selezionare il saggio del punto finale di assorbanza con una lunghezza d'onda impostata a 660 nanometri. Misurare l'assorbanza degli standard e dei campioni, salvare i risultati e tracciare una curva standard per determinare il microgrammo totale di proteine in ciascun campione.
Le misurazioni della fluorescenza del glucosio hanno mostrato un aumento dell'assorbimento di 6-NBDG nella retina di topo wild type dopo 30 minuti di incubazione, con un picco a 60 minuti, seguito da una diminuzione delle unità arbitrarie dopo 90 minuti. L'aggiunta dell'inibitore di GLUT1, bay 876, ha ridotto l'assorbimento di 6-NBDG del 24%, indicando il coinvolgimento di meccanismi indipendenti da GLUT1 nella retina del topo wild type.
