Abbiamo creato un modello individuale ricco di collagene per imitare l'ambiente che le cellule sperimentano in vivo utilizzando la tecnica di affollamento macromolecolare. La pelle è un ambiente affollato, a differenza dell'ambiente liquido che già usiamo per far crescere le cellule in vitro. Rispetto al tradizionale sistema di coltura cellulare monostrato, questo modello ricrea l'ambiente molecolare affollato che le cellule sperimentano in vivo, specialmente nei tessuti cicatriziali dove l'abbondante matrice extracellulare sposta l'acqua liquida.
Oltre alle cicatrici ipertrofiche, questa tecnica di affollamento macromolecolare può essere utilizzata per studi in cui la matrice extracellulare è abbondante, come la fibrosi polmonare. Coltiva fibroblasti normali e derivati dalle cicatrici secondo le indicazioni manoscritte. Quindi seminarli in 24 piastre di pozzo a 50.000 cellule per pozzo in un millilitro di mezzo.
Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Preparare l'affollamento macromolecolare o i supporti MMC mescolando Ficoll 70, Ficoll 400 e acido ascorbico in 10%FCS DMEM. Incubare i media in un bagno d'acqua per disperdere gli crowder nella soluzione.
Quindi sterilizzarlo con un filtro da 0,2 micrometri. Aspirare il supporto trascorso dai fibroblasti e sostituirlo con supporti MMC appena realizzati. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per sei giorni, cambiando il supporto MMC ogni tre giorni.
Preparare una soluzione Sirius Red sciogliendo 0,2 grammi di polvere Direct Red 80 in 200 millilitri di acqua deionizzata distillata con un millilitro di acido acetico. Aspirare il supporto MMC dalle cellule e aggiungere 300 microlitri di soluzione Sirius Red ad ogni pozzo. Quindi riportare le cellule nell'incubatrice per 90 minuti.
Dopo l'incubazione, sciacquare delicatamente la soluzione Sirius Red con acqua del rubinetto e lasciare asciugare l'aria durante la notte. Il giorno successivo, estrarre il Sirius Red aggiungendo 200 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1 in ogni pozzo e scuotendo la piastra per cinque-10 minuti. Trasferire 100 microlitri della macchia estratta in una piastra trasparente da 96 pozza e misurare l'assorbanza a 620 nanometri con un lettore di micro lastre.
Lavare ogni bene con 200 microlitri di PBS e fissare le cellule con metanolo a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere il 3%BSA ai pozzi e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere 200 microlitri di anticorpo anti-collagene ad ogni pozzo.
Incubare il piatto per 90 minuti. Quindi aspirare l'anticorpo E lavare i pozzi tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Aggiungere 200 microlitri di anticorpo secondario Goat Anti-Rabbit-FITC e DAPI ad ogni pozzo.
Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubarla per 30 minuti a temperatura ambiente. Scartare l'anticorpo secondario e il DAPI e ripetere i lavaggi con PBS. Quindi visualizzare la fluorescenza direttamente al microscopio.
Dopo aver lavato le celle due volte con PBS, aggiungere 40 microlitri di tampone di lysis in ogni pozzo e raschiare lo strato cellulare con una punta di pipetta. Quindi trasferire il lisato proteico in tubi di micro centrifuga per misurare la concentrazione proteica. Caricare 10 microgrammi di proteine in ogni pozzo di un gel proteico da quattro a 12%Bis-Tris ed eseguire SDS-PAGE a 200 volt per 30 minuti.
Al termine, trasferire la proteina in una membrana di nitrocellulosa eseguendo una macchia occidentale a 90 volt per 90 minuti, facendo attenzione ad evitare la formazione di bolle tra il gel e la membrana. Bloccare la membrana con 10 millilitri di tampone di blocco. Quindi incubarlo con anticorpi primari a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, lavare la membrana cinque volte con 0,1 percento TBS Tween 20 per cinque minuti per lavaggio. Quindi incubare la membrana con un anticorpo secondario appropriato per una specie per un'ora a temperatura ambiente. Ripetere i lavaggi e visualizzare la fluorescenza con un sistema di imaging.
Dopo aver purificato l'RNA totale con un kit di estrazione dell'RNA commerciale, misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a micro volume. Quindi utilizzare un kit di sintesi cDNA per eseguire una sintesi del DNA del primo filamento. Mescolare il cDNA con 10 microlitri di SYBR Green Supermix e trasferire i campioni su una piastra di pozzo 96 personalizzata pre-rivestita con primer oligonucleotidi.
Regolare il volume totale a 20 microlitri per pozzo con acqua ed eseguire RT-PCR in base alle indicazioni manoscritte. La densità cellulare dei fibroblasti della pelle umana derivati da cicatrici ipertrofiche è aumentata significativamente dopo la coltivazione con Ficoll rispetto all'uso del PVP o del controllo. L'affollamento macromolecolare con Ficoll a un'occupazione del volume frazionato del 9% ha notevolmente migliorato la deposizione di collagene, incluso quello di collagene, rispetto ad altre formulazioni.
Ciò è stato ulteriormente dimostrato con un'analisi quantitativa. Sono stati trovati fibroblasti derivati dalle cicatrici e normali fibroblasti dermici coltivati in ambienti MMC per regolare l'espressione delle specie ECM oltre al collagene. In particolare, è stata riscontrata un'elevata espressione di metalloproteinasi matriciali o MMP nei tessuti cicatriziali ipertrofi rispetto ai tessuti nativi.
È stato osservato che l'espressione di MMP2, nove e 13 era significativamente regolata in entrambe le colture cellulari coltivate in condizioni di affollamento macromolecolare. Gli MMP svolgono un ruolo importante durante la guarigione delle ferite e la formazione di cicatrici, regolando l'assemblaggio e il rimodellamento dell'ECM. La sintesi dell'interleuchina sei e del fattore di crescita endoteliale vascolare non era rilevabile in una macchia occidentale.
Ma l'analisi RT-PCR ha rivelato che l'espressione dell'interleuchina sei era significativamente regolata, mentre l'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare era down-regolata nei fibroblasti coltivati in condizioni MMC. Quando si tenta questo protocollo, è molto importante scegliere fibroblasti dermici che hanno pochissimi agenti patogeni co. Dobbiamo anche tenere presente che l'acido ascorbico è un ingrediente essenziale nel mezzo MMC.
Siamo particolarmente interessati a rilevare ulteriormente la deposizione e l'allineamento del collagene in questo modello MMC. Abbiamo in programma di utilizzare tecniche microscopiche avanzate per confrontare questo modello in vitro con tessuti cicatriziali nativi in vivo. Incoraggiamo gli altri a utilizzare questa tecnica di affollamento macromolecolare per migliorare l'autenticità in vitro dei tessuti modali ausiliari.
Naturalmente, l'affollamento macromolecolare può anche essere utilizzato per ricalcolare modelli di malattia e patologia in vitro.
