Vogliamo riconoscere lo spirito di cooperazione di tutti i membri Lab Caldwell. Un Basilico O&#39;Connor Scholar Award dal March of Dimes e un premio alla carriera dalla National Science Foundation per GAC, così come una laurea Scienze Research Grant programma dal Howard Hughes Medical Institute a La University of Alabama, hanno finanziato l&#39;eccitabilità neuronale e ricerca epilessia nel laboratorio di Caldwell.

Aldicarb esposizione Paradigm <ol><li> Il primo giorno, in modo che almeno trenta giovani vermi adulti fase di ogni genotipo e di ogni replica sarà disponibile per saggi aldicarb il secondo giorno. E &#39;meglio se uno sperimentatore seleziona cinquanta o più vermi stadio L4 su piastre NGM fresco (meglio senza nistatina), che contengono E. coli (preferibilmente OP50) come fonte di cibo, e farle crescere per 12-24 ore ad una temperatura costante e permissiva (20 ° C a 22 ° C è meglio, anche se 25 ° C va bene). </li><li> Il secondo giorno, fare un 100 soluzione madre mM di aldicarb con il 70% di etanolo (EtOH) e il 30% DDH 2 O. Diffondere la giusta quantità di aldicarb su piastre NGM meno nistatina con volumi definiti per raggiungere le concentrazioni aldicarb desiderato. Siamo costantemente uso aldicarb 0,5 mm con placcatura 37,5 ml di 100 mM aldicarb su piastre NGM 7,5 ml. Lasciare le piastre aldicarb ad asciugare per circa 30-60 minuti a temperatura ambiente. Non è necessario rompere i coperchi. In alternativa, aldicarb possono essere aggiunti al NGM e conservato a 4 ° C per una settimana. &nbsp;</li><li> Dopo l&#39;essiccazione dei volumi, piastra coerente di E. coli (preferibilmente OP50) sul centro di ogni piatto aldicarb e asciutta per altri 30-60 minuti a temperatura ambiente. Siamo costantemente piatto 25 ml di OP50, che crea un prato di dimensioni abbastanza cibo per mantenere i vermi concentrata in una piccola macchia, senza sovraffollamento. &nbsp;</li><li> Quando il prato cibo è secco, si può procedere con test aldicarb. A causa della natura soggettiva del test aldicarb, è altamente raccomandato che gli esperimenti devono essere eseguiti &quot;alla cieca&quot;. Un collega dello sperimentatore principale potrebbe ri-etichettare le tavole originali con i vermi da dosare. Allo stesso modo, il collega potrebbe trasferire i vermi dalle lastre originali di piatti aldicarb cifrati immediatamente prima di iniziare un timer. Se lo sperimentatore anticipa dosaggio un particolare ceppo di worm con un fenotipo caratteristico, come incoordinazione, allora ci deve essere anche un controllo con un fenotipo simile a ridurre i pregiudizi. Inoltre, è meglio se lo sperimentatore saggi uno ceppo selvatico, così come un ceppo resistente e un ceppo ipersensibile, in parallelo per standardizzare esperimenti. Lo sperimentatore dovrebbe sforzarsi di analizzare un numero consistente di vermi per ogni replica. Siamo costantemente analizzare thirty worm di un genotipo unico per ogni replica. Abbiamo anche eseguire almeno tre repliche per ogni esperimento. Uno sperimentatore esperto dovrebbe essere in grado di analizzare almeno sei ceppi alla volta. &nbsp;</li><li> Contare il numero di worm paralizzati da sollecitazione in modo coerente ogni vite senza fine con un filo di platino. Siamo costantemente i nostri prodotti vermi due volte sulla testa e due volte sulla coda ogni 30 minuti per un totale di tre ore. Cessazione di pompaggio faringea può anche essere utilizzato per definire la paralisi, ma solo se lo sperimentatore utilizza una definizione coerente di paralisi su tutti i test. Inoltre, vale la pena notare che alcuni worm, in particolare quelli che sono resistenti a aldicarb, può tentare di strisciare fuori dal piatto. In questo caso, lo sperimentatore può diffondere una quantità consistente di acido palmitico, una barriera fisica di locomozione vite senza fine, intorno le piastre aldicarb. Noi diffusione 25 ml di 10 mg di acido palmitico / ml EtOH. </li></ol> PTZ esposizione Paradigm <ol><li> Il primo giorno, in modo che almeno trenta giovani vermi adulti fase di ogni genotipo e di ogni replica sarà disponibile per saggi PTZ il secondo giorno. E &#39;meglio se uno sperimentatore seleziona cinquanta o più vermi stadio L4 su piastre NGM fresco (meglio senza nistatina), che contengono E. coli (preferibilmente OP50) come fonte di cibo, e farle crescere per 12-24 ore ad una temperatura costante e permissiva (20 ° C a 22 ° C è meglio, anche se 25 ° C va bene). </li><li> Il secondo giorno, fare una PTZ 0,5 g / ml soluzione madre DDH 2 O di PTZ. Diffondere la giusta quantità di PTZ su piastre NGM meno nistatina con volumi definiti per raggiungere le concentrazioni PTZ desiderato. Perché noi preferiamo dose-risposta test per PTZ, abbiamo piatto quantità variabili di PTZ su piastre NGM 7,5 ml. Per esempio, si può piatto 37,5 ml di soluzione madre PTZ su una lastra di 7,5 ml NGM fare una PTZ 5 mg / ml soluzione. Lasciare le piastre PTZ ad asciugare per circa 60-120 minuti a temperatura ambiente. Non è necessario rompere i coperchi. In alternativa, PTZ possono essere aggiunti direttamente al NGM, ma dovrebbe essere immediatamente utilizzate per le analisi dopo la solidificazione. La stabilità di PTZ è notevolmente inferiore a quella di aldicarb. Pertanto, le analisi con i piatti PTZ sono meno affidabili. PTZ devono essere conservati a -20 ° C in un essiccatore con un agente di asciugatura prima dell&#39;utilizzo. Noi preferiamo ignorare PTZ circa due mesi dopo l&#39;apertura per garantire la stabilità. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione dei volumi, piastra coerente di E. coli (preferibilmente OP50)sul centro di ogni piatto PTZ e asciutta per altri 30-60 minuti a temperatura ambiente. Siamo costantemente piatto 25 ml di OP50, che crea un prato di dimensioni abbastanza cibo per mantenere i vermi concentrata in una piccola macchia, senza sovraffollamento. &nbsp;</li><li> Quando il prato cibo è secco, si può procedere con test PTZ. Anche se i test PTZ sono meno soggettivi test aldicarb, è comunque altamente raccomandato che gli esperimenti devono essere eseguiti &quot;alla cieca&quot;. Un collega dello sperimentatore principale potrebbe ri-etichettare le tavole originali con i vermi da dosare. Allo stesso modo, il collega potrebbe trasferire i vermi dalle lastre originali di piatti PTZ cifrati immediatamente prima di iniziare un timer. Se lo sperimentatore anticipa dosaggio un particolare ceppo di worm con un fenotipo caratteristico, come incoordinazione, allora ci deve essere anche un controllo con un fenotipo simile a ridurre i pregiudizi. Inoltre, è meglio se lo sperimentatore saggi uno ceppo selvatico, oltre a ceppi con anteriore o full-body convulsioni, in parallelo per standardizzare esperimenti. Lo sperimentatore dovrebbe sforzarsi di analizzare un numero consistente di vermi per ogni replica. Siamo costantemente analizzare thirty worm di un genotipo unico per ogni replica. Abbiamo anche eseguire almeno tre repliche per ogni esperimento. Uno sperimentatore esperto dovrebbe essere in grado di analizzare almeno tre ceppi alla volta. Tuttavia, la frequenza e l&#39;intensità delle convulsioni di solito picco tra i 15-30 minuti di esposizione PTZ-indotta, e quindi attenuare come vermi diventano paralizzati o, in alcuni casi, abituare al farmaco. </li><li> Contare il numero di &quot;simil-epilettico&quot; convulsioni vermi ogni 30 minuti per un totale di un&#39;ora. E &#39;meglio di segnare il numero di worm con convulsioni anteriore, che noi chiamiamo &quot;testa-bob&quot;, separata dal numero di worm con tutto il corpo convulsioni, paralisi di tutto il corpo, che noi chiamiamo &quot;tonico&quot;, o una combinazione di convulsioni anteriore con paralisi BWM, che noi chiamiamo &quot;tonico-cloniche&quot;. La maggior parte dei worm di un singolo genotipo mostra solo un tipo di convulsioni. Tuttavia, tonico-cloniche worm spesso diventano completamente tonico, così si deve continuare il test negli ultimi 30 minuti, anche se tutti i worm hanno già esposto convulsioni. Inoltre, vale la pena notare che alcuni worm può tentare di strisciare fuori dal piatto. In questo caso, lo sperimentatore può diffondere una quantità consistente di acido palmitico attorno i piatti PTZ. Noi diffusione 25 ml di 10 mg di acido palmitico / ml EtOH. </li></ol> Le risposte comportamentali dei mutanti selezionati C. elegans trasmissione sinaptica a Aldicarb e PTZ <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Nome mutante </th><th> Ruolo Synaptic </th><th> Comportamento senza droga </th><th> Risposta comportamentale alla Aldicarb (rispetto al wild-type N2) </th><th> Risposta comportamentale di PTZ </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> inibisce la trasmissione sinaptica </td><td> scoordinata </td><td> tasso maggiore di paralisi </td><td> indistinguibile da wild-type </td></tr><tr><td> unc-43 (n498n1186) </td><td> complesso </td><td> scoordinata </td><td> tasso maggiore di paralisi </td><td> tutto il corpo convulsioni </td></tr><tr><td> unc-25 (e156) </td><td> promuove la trasmissione GABA </td><td> scoordinata </td><td> tasso maggiore di paralisi </td><td> anteriore convulsioni, paralisi di tutto il corpo </td></tr><tr><td> BNS-1 (md247) </td><td> promuove la trasmissione sinaptica </td><td> scoordinata </td><td> aliquota ridotta di paralisi </td><td> convulsioni anteriore </td></tr><tr><td> unc-4 (E120) </td><td> promuove ACh trasmissione </td><td> scoordinata </td><td> aliquota ridotta di paralisi </td><td> indistinguibile da wild-type </td></tr></tbody></table> Due stimolanti neurale, un inibitore dell&#39;acetilcolinesterasi, chiamato aldicarb, e un antagonista del recettore GABA, chiamato pentylenetetrazole (PTZ), possono essere utilizzati in modo complementare a caratterizzare mutanti trasmissione sinaptica C. elegans. Eccesso di acetilcolina eccitatorio (ACh) si accumula a vite senza fine corpo muro giunzioni neuromuscolari (NMJs) da mutazioni deleterie in regolatori negativi di ACh trasmissione (ad esempio tom-1 e unc-43) o regolatori positivi di inibitori trasmissione GABA (ad esempio, unc-25). Al contrario, i livelli di ACh eccitatorio a NMJs verme sono diminuiti da mutazioni deleterie nei regolatori positivi della trasmissione sinaptica generale (ad esempio, BNS-1) o ACh geni specifici di trasmissione (ad esempio unc-4). Rispetto ai wild-type worm N2, worm mutante con elevata trasmissione eccitatoria ACh a NMJs mostra maggiorazioni aldicarb paralisi indotta, mentre i vermi mutanti con abbassato trasmissione eccitatoria ACh dimostrare aliquote ridotte dell&#39;imposta sul aldicarb indotta paralisi. Anche se PTZ interrompe la sincronia dei neuroni a muscoli del corpo C. elegans muro e non, a differenza di aldicarb, PTZ antagonizza anche inibitorio GABA in C. elegans muscoli della testa. Di conseguenza, la sensibilità aldicarb non può prevedere con precisione la sensibilità PTZ. Vermi mutanti con difetti specifici nel regul negativa o positivazione della trasmissione ACh sono indistinguibili da wild-type vermi N2 in presenza di PTZ, mentre i vermi mutanti con difetti nella regolazione positiva del generale trasmissione sinaptica o difetti specifici inibitori mostra trasmissione GABA robusta convulsioni anteriore PTZ-indotta. Inoltre, unc-43 con perdita di funzione di mutanti visualizzare tutto il corpo convulsioni in presenza di PTZ e probabilmente ulteriori anomalie trasmissione sinaptica, che contribuiscono alla loro risposta ai farmaci unico.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

Attuali protocolli per l&#39;esposizione aldicarb con C. elegans sperimentatori non permettono di distinguere tra mutanti con deficit specifici nella trasmissione ACh e mutanti con un deficit generalizzato nella trasmissione sinaptica, in quanto entrambe le classi di mutanti mostrano resistenza al aldicarb. Allo stesso modo, aldicarb non può essere utilizzata per determinare se i mutanti hanno deficit specifici nella trasmissione GABA o fallimenti generalizzati di regolare negativamente ACh trasmissione, in quanto entrambe le clas...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

Il nematode, Caenorhabditis elegans, è diventato un modello utile per lo studio di neurotrasmissione. C. elegans è unico tra i modelli animali, come l&#39;anatomia e la connettività del suo sistema nervoso è stata determinata dal microscopio elettronico e raffinato da saggi farmacologici. In questo video viene descritto come due stimolanti complementari neurali, un inibitore dell&#39;acetilcolinesterasi, chiamato aldicarb, e un acido gamma-aminobutirrico (GABA), antagonista dei recettori, chiamati pentylenetetrazole (PTZ), possono essere impiegate per caratterizzare specificamente segnalazione a C. elegans giunzioni neuromuscolari (NMJs) e facilitare la nostra comprensione di antagoniste circuiti neurali. C. elegans di 302 neuroni, diciannove GABAergici di tipo D motoneuroni innervano i muscoli del corpo a parete (BWMs), mentre quattro neuroni GABAergici, chiamato RMEs, testa innervano i muscoli. Al contrario, 39 motoneuroni esprimere il neurotrasmettitore eccitatorio, l&#39;acetilcolina (ACh), e antagonizzano la trasmissione GABA a BWMs per coordinare locomozione. La natura antagonista dei neuroni colinergici e GABAergici motore a corpo NMJs muro è stato inizialmente determinato da ablazione laser e poi sostenuta da esposizione aldicarb. Di esposizione acuta risultati aldicarb in una paralisi tempo portate o dose-risposta in wild-type vermi. Tuttavia, la perdita di trasmissione eccitatoria ACh conferisce resistenza agli aldicarb, come meno ACh si accumula a NMJs verme, portando a meno di stimolazione BWMs. Resistenza alla aldicarb può essere osservata con ACh-specifico o generale mutanti funzione sinaptica. Coerentemente con antagonisti GABA e ACh trasmissione, perdita di trasmissione GABA, o la mancata regolare negativamente ACh rilascio, conferisce ipersensibilità al aldicarb. Sebbene l&#39;esposizione aldicarb ha portato all&#39;isolamento di omologhi verme numerosi geni neurotrasmissione, l&#39;esposizione aldicarb da sola non può determinare in modo efficiente ruoli prevalente per i geni e sulle vie di specifiche C. elegans motoneuroni. A questo scopo, abbiamo introdotto un approccio complementare sperimentale, che utilizza PTZ. Mutanti neurotrasmissione visualizzare fenotipi chiaro, distinto da aldicarb indotta paralisi, in risposta alle PTZ. Wild-type worm, così come mutanti con specifiche incapacità di rilasciare o ricevere ACh, non mostrano sensibilità apparente PTZ. Tuttavia, mutanti GABA, così come generale mutanti funzione sinaptica, display convulsioni anteriore in modo tempo-corso o dose-risposta. Mutanti che non possono negativamente regolano il rilascio dei neurotrasmettitori generale e, quindi, secernono quantità eccessive di ACh su BWMs, diventano paralizzati su PTZ. Il PTZ-indotta fenotipi di discrete classi mutanti indicano che un approccio complementare con aldicarb e paradigmi esposizione PTZ in C. elegans possono accelerare la nostra comprensione della neurotrasmissione. Inoltre, i video che dimostrano come si eseguono i test farmacologici dovrebbero stabilire metodi coerenti per la ricerca C. elegans.

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Questo video dimostra come utilizzare due stimolanti neurali, aldicarb e pentylenetetrazole (PTZ), in modo complementare per studiare la funzione sinaptica nel nematode, C. elegans. Questo approccio complementare può essere utilizzato anche per far luce sui meccanismi evolutivamente conservata per modulare la sincronia dei neuroni e ha implicazioni per l&#39;epilessia e convulsioni.

Paradigmi per la caratterizzazione farmacologica di C. elegans Mutanti trasmissione sinaptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  University of Alabama. Questo video dimostra come utilizzare due stimolanti neurali, aldicarb e pentylenetetrazole (PTZ), in modo complementare per studiare la funzione sinaptica nel nematode, C. elegans. Questo approccio complementare può essere utilizzato anche per far luce sui meccanismi evolutivamente conservata per modulare la sincronia dei neuroni e ha implicazioni per l'epilessia e convulsioni.

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Ricerca

Biologia

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Saggi Neurocircuit per Sequestri in mutanti di Epilessia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...