Le malattie muco-ostruttive sono caratterizzate da viscosità anormale del muco delle vie aeree. Il protocollo mostra come utilizzare la reologia per quantificare la viscosità del muco e analizzare i dati per testare i trattamenti mirati al muco. La reologia del muco fornisce biomarcatori quantitativi specifici.
L'utilizzo di un dispositivo da banco semplifica notevolmente la logistica della misurazione di questi biomarcatori in campioni clinici come campioni di espettorato umano. L'uso della reologia del muco come strumento di diagnosi per le malattie ostruttive è ancora una sfida. Un numero crescente di prove mostra una forte correlazione tra proprietà reologiche, infiammazione e infezione batterica.
Il muco è sempre presente nell'interfaccia corporea dove lubrifica e svolge un ruolo protettivo. La reologia del muco può essere applicata ad altri sistemi come le tracce gastrointestinali e genitali. Per acquisire misurazioni accurate, è fondamentale la corretta gestione e il posizionamento del campione.
Una dimostrazione visiva può migliorare la precisione di questo test. A dimostrare questa procedura sarà Kendall Shaffer, un tecnico di ricerca del laboratorio aereo. Inizia ordinando l'espettorato o il muco delle vie aeree raccolti in tazze di campioni sterili.
Nel caso dell'espettorato, rimuovere la saliva in eccesso dal campione immediatamente dopo la raccolta. Posizionare i campioni sul ghiaccio per il trasporto. Limitare il tempo di trasporto a meno di quattro ore.
Analizzare i campioni al momento della raccolta. Omogeneizzare il muco tubando delicatamente su e giù da tre a cinque volte con una pipetta a spostamento positivo. O pipettare direttamente nei tubi microcentrifuga.
Conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino a quando non vengono elaborati. Aliquotare i campioni per la conservazione in volumi maggiori o uguali a 500 microlitri per garantire un volume sufficiente per gli esperimenti. Prima dell'aliquotazione, pipettare direttamente l'espettorato o il muco fresco e congelato o omogeneizzare i campioni.
Riparare le aliquote richieste per misurazioni e trattamenti ripetuti. Incubare le aliquote da testare a 37 gradi Celsius per almeno cinque minuti prima della misurazione. Per testare gli agenti farmacologici, utilizzare alte concentrazioni di soluzioni stock per prevenire la diluizione del campione.
Aggiungere tra l'1% e il 10% del volume del reagente desiderato direttamente sul campione. Assicurarsi che nessuna goccia del composto rimanga sul lato del tubo. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per il periodo di tempo richiesto, per consentire una reazione chimica.
Mescolare il campione di muco e il reagente facendo scorrere il fondo della provetta di microcentrifuga ogni due minuti per consentire la progressiva penetrazione del reagente nel campione di muco senza compromettere la rete di mucina. Quando si confrontano più reagenti farmacologici, assicurarsi che il tempo di incubazione sia simile. Accendere la macchina e inizializzare il software.
Selezionare una nuova misurazione. Immettere il numero di identificazione del campione in ID misura e il nome dell'operatore in Operatore per continuare. Immettere ulteriori informazioni o commenti in Commenti.
Selezionare un set di geometrie e ispezionare attentamente piastre grandi e piccole, per assicurarsi che le piastre siano pulite e in perfette condizioni. Inserire saldamente la grande piastra sul pulpito inferiore. Inserire delicatamente la piccola piastra sul pulpito superiore e bloccare la piastra ruotando leggermente fino a sentire un clic, il che indica che la piastra è correttamente bloccata.
Si noti che l'oscillazione libera della piastra superiore è normale. Attendere che la temperatura raggiunga il valore target di 37 gradi Celsius. Quindi avviare la calibrazione automatica, come richiesto dal software.
Utilizzando una pipetta a spostamento positivo, pipettare lentamente tra 250 e 500 microlitri del campione al centro della grande piastra inferiore. Una volta depositati sulla piastra, i campioni viscosi adotteranno una forma a cupola, mentre i campioni altamente elastici possono richiedere il taglio fisico. Abbassare la testa di misura che trasporta la piccola piastra tramite il software e osservare il campione.
Se caricato correttamente sulla piastra inferiore, il campione entrerà in contatto e sarà centrato tra le due piastre. Per garantire che il campione riempia il vuoto, utilizzare la funzione di gap ridotto fino a quando il campione non è più nella forma biconcava o allineato con il bordo della piastra. La funzione di gap ridotto abbassa il bordo di misura con incrementi di 0,1 millimetri ed è limitata a 7 incrementi.
Se rimane uno spazio vuoto dopo i 7 incrementi, fare clic su Ripeti installazione per tornare alla posizione iniziale e regolare la posizione e il volume del campione. Se lo spazio è estremamente ridotto, rimuovere il campione in eccesso con una spatola con un movimento circolare lungo il bordo della piastra superiore. Tagliare delicatamente il campione in eccesso per evitare stress da taglio.
Abbassare il coperchio protettivo per evitare qualsiasi proiezione accidentale di fluidi contaminati durante l'oscillazione. Per avviare la misurazione, fare clic su Avvia analisi. Un intero ciclo richiederà da quattro a sette minuti.
Evitare di parlare ad alta voce e toccare il dispositivo o il banco durante l'intera durata del ciclo. Un ambiente tranquillo è fondamentale per i primi due minuti. Una volta completato il ciclo, fare clic su Avanti per sollevare la testa di misurazione e generare il rapporto di analisi del campione.
Una volta che la testa di misurazione è completamente retratta, sollevare il coperchio protettivo. Scartare il campione e rimuovere con cura le piastre. Pulire e disinfettare le piastre con acqua tiepida e sapone.
Le caratteristiche viscoelastiche di otto megadalton PEO sono state misurate a cinque concentrazioni e confrontate direttamente tra il reometro da banco valutato e un reometro sfuso tradizionale. In contrasto con le soluzioni PEO, lo stato asmatico del muco rappresenta un comportamento dominato elastico simile a un solido a basso sforzo e presenta un crossover ad alto sforzo. Inoltre, le misurazioni triplicate eseguite in soluzione di PEO all'1,5% e campione di muco del saggio clinico, hanno confermato che le caratteristiche viscoelastiche lineari erano altamente ripetibili per i valori ottenuti dal campione biologico.
Sono stati misurati cambiamenti nelle proprietà viscoelastiche del muco dopo il trattamento con un agente mucolitico. Gli effetti del TCEP sulla viscoelasticità del muco sono stati testati in un ambiente clinico utilizzando il reometro da banco. Il trattamento mucolitico ha portato a un campione più fluido con una diminuzione del modulo complesso di 4,6 volte, modulo elastico di 5,1 volte, modulo viscoso di 1,9 volte, deformazione crossover di 3,3 volte e stress di snervamento crossover di 5,7 volte e un aumento del rapporto di smorzamento di 2,8 volte.
Misurare la viscoelasticità del muco delle vie aeree in un ambiente clinico frenetico può aiutare a personalizzare il trattamento dei pazienti caso per caso, oltre a fornire un protocollo standardizzato per testare nuovi composti farmacologici. Questa tecnica è attualmente utilizzata per esaminare gli effetti di modulatori CFTR altamente efficaci sull'espettorato della fibrosi cistica e per testare la potenza di vari farmaci volti ad alterare le proprietà del muco.
