Le tecniche qui sono stati sviluppati con finanziamenti da sovvenzioni da parte del Department of Energy (Scienze della bioenergia) e la National Science Foundation.

Parte 1: Crescere e stoccaggio di materiale vegetale idoneo <ol><li> Nella nostra esperienza, hypocotyls giovani piantine di cetriolo eziolata servire come comoda fonte di materiale della parete cellulare per questi esperimenti. Semi di cetriolo vengono seminati su carta bagnata in un box a prova di luce, che è conservato in un armadio buio in un ambiente a temperatura costante di 26 ° C. La temperatura esatta non è critica, come qualcosa tra i 22 ° e 30 ° C dovrebbe andare bene, ma la temperatura a determinare la velocità di piantine raggiungere un adeguato livello di sviluppo. Il più caldo la temperatura, più velocemente le piantine si svilupperanno. Usiamo tipicamente piantine quando sono cresciuti di circa 5 cm di lunghezza, che si raggiunge 3-4 giorni dopo la semina. E &#39;importante che la piantina è cresciuta al buio, in quanto anche piccole quantità di luce influenzano sia il tasso di sviluppo piantina e le proprietà della parete cellulare, che si misura con questa tecnica. Il giorno 3 si può sbirciare nella scatola, con una fioca luce verde filtrata, per controllare lo sviluppo piantina. </li><li> Piantine si stanno rapidamente tagliate e confezionate in piccole scatole di plastica, 100-150 piantine per scatola, e conservati a -80 ° C. A questa temperatura rimangono utili per settimane. </li></ol> Parte 2: Preparazione di campioni di parete cellulare <ol><li> Piccoli gruppi (8-10) di piantine taglio congelati sono trasferiti dal congelatore un contenitore isolato contenente un blocco -80 congelatore. </li><li> La cuticola che copre il ipocotile è abrasa con carborundum. Questo viene fatto ripetutamente il disegno ipocotile tra il pollice e l&#39;indice, che sono rivestiti con un impasto denso di umida polvere carborundum. Ci vuole un po &#39;di esperienza per conoscere la giusta quantità di pressione da utilizzare: troppa pressione e lo strato epidermico comincia ad essere triturati e lacerato, troppo poca pressione e la cuticola non sarà permeabilizzate. Bisogna anche lavorare velocemente, perché il gelato si scioglie ipocotile, diventa flaccido e difficile da gestire. </li><li> L&#39;ipocotile abrasa è immerso in acqua ghiacciata per rimuovere la maggior parte del carborundum aderente e poi memorizzati su acqua ghiacciata hypocotyls mentre i rimanenti sono preparati in modo simile. </li><li> Il hypocotyls sono tagliati alla lunghezza desiderata, di solito 1,2 cm, con una nuova singola lama di rasoio taglio e poi allineati su un vetrino. </li><li> Ora abbiamo bisogno di appiattire le mura di togliere linfa cellulare e per facilitare la chiusura. Una diapositiva secondo bicchiere è posto sulla parte superiore del gruppo di 8-10 campioni, formando un panino. Un peso (400-500 g) è posto sulla parte superiore del vetrino per 5 minuti. Per il peso che usano abitualmente un bicchiere contenente una quantità adeguata di acqua. </li><li> Passaggio facoltativo: a seconda della sperimentazione, il hypocotyls può essere inattivato con un breve trattamento termico a questo punto. Per fare questo si legano le diapositive di vetro insieme ad una coppia di elastici, inserire l&#39;assembly in un contenitore con 100 ml di acqua deionizzata a temperatura ambiente e metterla in un forno a microonde alla massima potenza. Con il nostro forno a microonde l&#39;acqua inizia a bollire a circa 50 s e ci fermiamo al microonde 15 s dopo la bollitura ha inizio. L&#39;acqua calda è subito travasato e sostituita con acqua fredda per fermare denaturazione. Potrebbe essere necessario variare questi tempi, come il vostro forno a microonde può essere diversa dalla nostra. Con riscaldamento eccessivo i campioni si indeboliscono e si rompono facilmente. Con un riscaldamento insufficiente il espansina endogeno non viene inattivata ed i campioni di muro conservano alcuni reattività a pH acido. </li></ol> Parte 3: setup Estensimetro <ol><li> I campioni muro ora sono bloccati in un estensimetro forza costante. Questa è una custom-built dispositivo che consiste in una vaschetta in plexiglas per lo svolgimento del fine basale del campione muro e un morsetto mobile fissato all&#39;estremità apicale del campione. Il morsetto mobile è montata all&#39;estremità di una barra che passa attraverso le bobine aperto di un sensore di posizione, un LVDT o &#39;differenziali variabili lineari Transformer&#39;, che rileva elettronicamente la posizione di un cilindro di metallo, o &#39;core&#39;, che è attaccato alla barra. L&#39;estremità superiore della barra è collegato a una leva con un contrappeso regolabile. Questa leva esercita una quantità regolabile di forza verso l&#39;alto sul campione muro. La forza viene regolata con l&#39;aggiunta o la rimozione dei pesi in metallo calibrato all&#39;estremità della leva. </li><li> Torna il campione muro - alla fine basale del campione ipocotile viene prelevato con una pinza sottile e ~ 2-3 mm dell&#39;estremità apicale è collocato tra le fauci spalancate del morsetto mobile. Questo morsetto è una molla morsetto a coccodrillo in metallo le cui fauci sono rivestiti di plastica per evitare il contatto diretto tra la superficie metallica e la soluzione tampone e il campione muro. Nella nostra esperienza di ioni metallici può percolare dal morsetto e inibiscono la capacità del muro di estendere, e così teniamo il metallo coperti. </li><li> Tenendo la pinza di montaggio mobili in una mano, la fine basale del campione muro è ora manovrato tra i due pezzi cerniera della vaschetta in plexiglas e la cuvettapezzi sono riuniti ed avvitato, in modo da bloccare l&#39;estremità inferiore del muro campione nella cuvetta. </li><li> L&#39;assemblea pinza mobile è ora gentilmente rilasciato, consentendo la piena forza dei contrappesi da trasferire al modello a parete. Noi abitualmente uso di un contrappeso totale di 20 g per i campioni preparati da parete hypocotyls cetriolo. Pareti di materiali o altri esperimenti potrebbe richiedere diversi pesi. </li><li> La cuvetta è piena di tampone (200 uL) e la posizione della cuvetta spostato verso l&#39;alto o verso il basso con una vite di regolazione, in modo che la pinza mobile è portato al limite inferiore del campo di misura LVDT. Il nostro LVDT è collegato ad una unità di acquisizione dati di un microcomputer, e così abbiamo monitorare la posizione LVDT attraverso il computer. Abbiamo otto assemblee LVDT collegato in parallelo con un computer, che ci permette di eseguire 8 campioni muro simultaneamente. Il computer registra la posizione di ciascuna delle assemblee LVDT una volta ogni 30 s. </li></ol> Parte 4: risposta estensione di misura a pH acido o espansina - Risultati Rappresentante <ol><li> [Primo esperimento] Per la misura di acido-indotta estensione, iniziamo con i campioni muro nativo (cioè non inattivato con il calore) e tampone neutro viene aggiunto alla cuvetta. I campioni muro si estendono per qualche minuto, in risposta alla tensione aggiunto, ma la decade estensione a un basso tasso dopo pochi minuti. Il nostro computer ci permette di monitorare entrambi la variazione della lunghezza del campione (cioè il cambiamento nella posizione della pinza mobile, dopo l&#39;inizio della sperimentazione) o siamo in grado di monitorare la derivata temporale della posizione, in altre parole il tasso di estensione . Il tasso di estensione si stabilizza ad un valore basso con il tempo. </li><li> Dopo circa 20 minuti, il buffer neutro viene rimosso. Noi usiamo un tubo di metallo sottile, fatto da un ago ipodermico grande calibro, collegato ad una pompa a vuoto per rimuovere il buffer in modo rapido, con il minimo disturbo della parete o il montaggio meccanico. Tampone acido è poi aggiunto, a volte con 1-2 scambi resoconto di assicurare lo scambio completo di tampone acido. Poi ci sediamo a guardare la risposta del muro. Di solito siamo in grado di rilevare il tasso più veloce di estensione in pochi minuti. Dopo 60 min di solito abbiamo abbastanza informazioni per valutare la risposta di estensione, sebbene in alcuni casi le misurazioni possono estendersi a periodi più lunghi. </li><li> [Secondo Esperimento] Per la misura di espansina indotta estensione della parete cellulare, si inizia con campioni di siero a muro e con un tampone acido viene aggiunto alla cuvetta. Come nel primo esperimento, il tasso di estensione della parete cellulare stabilizza gradualmente a un valore basso a causa della mancanza di espansina funzionale. </li><li> Dopo circa 20 minuti, le proteine ​​espansina viene aggiunto alla cuvetta da &#39;chiodare&#39; con il tampone nella cella con 10-20 uL di una soluzione espansina. Il espansina penetra rapidamente il campione parete cellulare e in pochi minuti si vede che il tasso di estensione è aumentata. Questa risposta estensione può essere seguito per un&#39;ora o più. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> Figura 1: Schema di procedure per la preparazione di pareti cellulari per valutare acido-indotta o espansina indotta estensione muro.

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	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls.">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li><li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well.">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li><li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima.">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins.">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li><li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants.">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li></ol>

Per questa dimostrazione abbiamo usato le pareti delle cellule da hypocotyls cetriolo perché hanno dimostrato di essere una fonte affidabile di campioni di muro che sono facili da maneggiare e che rispondono con una buona sensibilità. Abbiamo anche avuto un buon successo con le pareti di altre piantine così come alcuni materiali dal supermercato, come foglie di spinaci giovani e gambi di sedano. In sostanza, giovane, morbido, tessuti vegetali in rapida crescita sono suscettibili di essere facilmente misurato con ques...

measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic ph and by alpha-expansin

Crescente pareti delle cellule vegetali tipicamente mostrano una proprietà conosciuta come &#39;la crescita acido&#39;, con la quale si intende che sono più estensibili a pH basso (&lt;5) 1. L&#39;ormone vegetale auxina stimola l&#39;allungamento delle cellule in rapida steli giovani e tessuti simili, almeno in parte da un acido-crescita meccanismo 2, 3. Auxina attiva una pompa H + nella membrana plasmatica, che causano l&#39;acidificazione della soluzione di parete cellulare. Acidificazione muro attiva espansine, che sono endogeni-allentamento della parete cellulare delle proteine ​​4, causando la parete cellulare di cedere alle tensioni muro creato dalla pressione di turgore delle cellule. Come risultato, la cellula comincia a ingrandire rapidamente. Questo fenomeno di &#39;crescita acido&#39; è facilmente misurata in campioni di cellule isolate (non vivente) muro. La capacità delle pareti delle cellule di sottoporsi acido-indotta estensione non è semplicemente il risultato della sistemazione strutturale di polisaccaridi della parete della cella (pectine ad esempio), ma dipende dall&#39;attività di espansine 5. Espansine non hanno conosciuto alcuna attività enzimatica e l&#39;unico modo di saggiare per l&#39;attività espansina è quello di misurare la loro induzione di estensione della parete cellulare. Questa relazione Dettagli video le fonti e tecniche di preparazione per l&#39;ottenimento di Pareti di materiali idonei per saggi espansina e continua a mostrare acido-indotta estensione e espansina indotta estensione dei campioni parete preparata da hypocotyls cetriolo in crescita. Per ottenere campioni idonei parete cellulare, cetriolo piantine sono cresciute al buio, la hypocotyls sono tagliati e congelati a -80 ° C. Hypocotyls congelati sono abrase, appiattito, e poi bloccato a tensione costante in una cuvetta speciale per misure estensimetro. Per misurare l&#39;acido-indotta estensione, le pareti sono inizialmente tamponato a pH neutro, con conseguente bassa attività di espansine che sono componenti delle pareti cellulari native. Al cambio di buffer a pH acido, espansine sono attivate e le pareti cellulari estendere rapidamente. Abbiamo anche mostrato attività espansina in un test di ricostituzione. Per questa parte, usiamo un breve trattamento termico a denaturare le espansine nativo nei campioni di parete cellulare. Queste pareti cellulari inattivato non si estendono anche in tampone acido, ma aggiunta di espansine alle pareti delle cellule ristabilisce rapidamente la loro capacità di estendere.

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Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Dimostriamo l&#39;uso di un estensimetro a forza costante per misurare la estensione a lungo termine (creep) di campioni di cellule vegetali muro indotta da buffer acidi e proteine ​​espansina.

Cella di misura Estensione impianto a parete (Creep), indotta dal pH acido e da Alpha-espansina

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

13.9K Views.  Penn State University. Dimostriamo l'uso di un estensimetro a forza costante per misurare la estensione a lungo termine (creep) di campioni di cellule vegetali muro indotta da buffer acidi e proteine ​​espansina.

Video: Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titolo Incapsulamento cella di goccioline

Ricerca

Biologia

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identificazione dei fenotipi inibizione della crescita indotta da Espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block Microcosmi per decomposizione controllata tessuti vegetali da Funghi aerobica

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

Versando ed esecuzione di un gel proteico riutilizzando Cassettes commerciali

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...