La mancanza di marcatori specifici per i nanotubi a effetto tunnel limita i progressi nel campo e vi è una crescente domanda di un metodo per identificare, caratterizzare e quantificare i nanotubi a effetto tunnel. I metodi di rilevamento automatico sono difficili da implementare senza l'esperienza per sviluppare un algoritmo e / o modificare l'algoritmo esistente, ma il nostro metodo manuale è facile da implementare con maggiore precisione. Il trasferimento intercellulare a lungo raggio tramite nanotubi a tunnel è implementato in diversi modi in vari modelli di malattia, tra cui la patologia neurodegenerativa, la diffusione virale e il cancro.
Pertanto, gli studi sui nanotubi a effetto tunnel per comprendere il loro ruolo nella patogenesi sono importanti. È possibile che i nanotubi a effetto tunnel possano rompersi durante il processo di colorazione. Evitare l'uso di vetrine di copertura e il montaggio sulle diapositive, utilizzando invece piastre di imaging con fondo in vetro.
Il protocollo di fissazione modificato aiuta a mantenere intatti i nanotubi tunneling. A dimostrare la procedura sarà Deepak KV, dottorando del laboratorio di Sangeeta NAF. Per iniziare, lavare il controllo e le cellule oligomeriche trattate con A-beta due volte con PBS per due minuti prima della fissazione.
Preparare la soluzione fissativa di Karnovsky utilizzando il fissativo al 2% di formalina e il 2,5% di glutaraldeide disciolti in tampone fosfato molare 0,1 di pH 7,2. Quindi fissare le cellule nel piatto di imaging aggiungendo la soluzione fissativa di Karnovsky per 45 minuti a temperatura ambiente. Preparare il tampone di incubazione sciogliendo 0,1 grammi di saponina in cinque millilitri di FBS e diluito aggiungendo 95 millilitri di PBS.
Quindi lavare le celle fisse due volte utilizzando il tampone di incubazione per due minuti. Dopo la fissazione, aggiungere il primo anticorpo contro il fosfo-PAK1, aggiungere una diluizione da uno a 250 nel tampone di incubazione e incubare per una notte a quattro gradi Celsius in una camera buia e umida. Il giorno successivo, dopo 24 ore di incubazione, lavare le cellule due volte con il tampone di incubazione per due minuti.
Quindi aggiungere anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor 488 e Phalloidin 555. Incubare le cellule nella camera buia e umida per 1,5 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con tampone di incubazione per due minuti.
Colorare il nucleo aggiungendo DAPI in una diluizione da uno a 2000 e incubare per cinque a 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Preparare il mezzo di montaggio DABCO utilizzando 25 milligrammi di DABCO in glicerolo al 90% e PBS al 10%. Per sciogliere correttamente, regolare il pH a 8,6 utilizzando acido cloridrico diluito di grado spettrofotometrico e mantenere la soluzione su un bilanciere per la miscelazione.
Come agente anti-sbiancamento, aggiungere il supporto di montaggio DABCO direttamente sulla piastra di imaging contenente il vetrino di copertura nella parte inferiore. Attendere almeno una o due ore e procedere direttamente all'esecuzione dell'imaging confocale. Per identificare i nanotubi tunneling, acquisire immagini Z-stack di cellule immunocolorate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale selezionando prima i canali e facendo clic sui laser richiesti in sequenza nelle finestre traccia uno, traccia due e traccia tre nel software confocale.
Fare clic sull'opzione TPMT sotto la finestra traccia uno per acquisire le immagini di contrasto di interferenza differenziale con i canali di fluorescenza. Selezionare la scheda Acquisizione del software, fare clic sulla scheda Z-stack e attendere che si apra una finestra. Quindi fare clic su Live Scan per mettere a fuoco le celle nella parte inferiore del piatto.
Selezionare l'immagine attiva come prima pila, quindi mettere a fuoco verso l'alto per visualizzare la parte più in alto della cella e selezionarla come ultima pila. Interrompere la scansione in tempo reale e fare clic sul numero accanto alla scheda Ottimale per correggere la dimensione del passo delle pile che determina il numero di sezioni e gli intervalli in base allo spessore delle celle. Acquisisci immagini sequenziali di tre canali DAPI, FITC e TRITC con laser a 405 nanometri, 488 nanometri e 561 nanometri e acquisisci con un tempo di permanenza dei pixel di 1,02 microsecondi.
Cattura immagini nel canale DIC con canali di fluorescenza per osservare il confine cellulare. Apri le immagini confocali salvate in formato dati czi nel software Fiji per l'analisi. Selezionare l'opzione Hyperstack per visualizzare ogni Z-stack e canale dell'immagine.
Scorri il canale e le barre di scorrimento Z-stack per selezionare lo stack esatto di un particolare canale di interesse. Quindi selezionare prima il canale colorato di F-actina scorrendo la barra dei canali e scorrere manualmente le pile Z per vedere ciascuna pila una per una. Identificare le strutture colorate con F-actina che sembrano collegare le cellule che sono visibili nelle parti inferiori delle pile Z e sono vicine alla superficie della parabola di imaging con Z uguale a due come neuriti.
Identificare i nanotubi tunneling, i condotti F-actina positiva da cella a cellula facendo scorrere le pile Z verso l'alto da Z uguale a quattro. Cerca i neuriti vicino alle parti inferiori delle pile Z verso la superficie e osserva che iniziano a scomparire con lo scorrimento delle pile Z verso l'alto a Z uguale a sei. Identificare i nanotubi tunneling positivi al fosfo-PAK1 in modo simile ai nanotubi tunneling positivi F-actina analizzando la natura sospesa dei condotti dalle pile Z.
Poiché la colorazione fosfo-PAK1 è più debole della colorazione F-actina, cercare nanotubi tunneling colorati con fosfo-PAK1 a Z uguale a quattro e a Z uguale a sei. Inoltre, osservare le immagini DIC per verificare che le strutture dei nanotubi tunneling colorati con F-actina e fosfo-PAK1 siano condotti di membrana tra le cellule. Inoltre, unire i canali F-actina e fosfo-PAK1 per verificare che i nanotubi tunneling identificati siano strutture co-colorate con F-actina e fosfo-PAK1.
Per quantificare i nanotubi tunneling, contare manualmente il numero totale di celle e i nanotubi a effetto tunnel identificati e rappresentare i numeri in percentuale. Per distinguere i nanotubi tunneling positivi per la tubulina F-actina e beta III come condotti sospesi dalle immagini Z-stack, unire i canali della tubulina F-actina e beta III, quindi analizzare gli stack Z delle immagini unite. Cerca esclusivamente nanotubi a tunnel colorati con F-actina che sono debolmente visibili a Z uguale a tre e prominenti a Z uguale a sei e Z uguale a nove.
Allo stesso modo, identificare F-actina e tubulina beta III. nanotubi a effetto tunnel a doppio positivo come condotti sospesi a Z uguale a sei e Z uguale a nove. Identificare altre sporgenze non sospese colorate con tubulina F-actina e beta III dalle parti inferiori delle pile Z.
Misurare il diametro dei nanotubi a effetto tunnel utilizzando lo strumento Linea nelle Figi. Verificare la scala di misura facendo clic su Analizza e quindi impostare la scala in modo che la distanza in pixel venga impostata automaticamente dalle immagini czi. Misurare i diametri dei nanotubi tunneling sul piano XY.
Utilizzando il plug-in Volume Viewer nelle Fiji che consente il re-slicing 3D e la visualizzazione 3D abilitata alla soglia, suddividere le immagini Z-stack in singoli canali. Quindi ritaglia le immagini Z-stack a canale singolo per utilizzare la vista di ricostruzione 3D per evidenziare uno o due nanotubi o neuriti tunneling alla volta. Appuntare un singolo nanotubo o neurite tunneling nel piano XY e contrassegnare le sezioni trasversali di accesso XZ e YZ.
Osservate i neuriti nella parte inferiore del piano XZ, nei piani XZ e YZ, e i nanotubi tunneling nelle pile Z superiori. Selezionare i singoli nanotubi o neuriti a effetto tunnel per ricostruire la vista del volume 3D nel piano XZ. Nella ricostruzione 3D, osserva i neuriti sul fondo del piano Z e i nanotubi a tunnel che appaiono come strutture sospese che collegano due cellule senza toccare il piano Z inferiore.
Sono state analizzate immagini confocali Z-stack di cellule immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1 per identificare nanotubi tunneling. Inoltre, le immagini DIC sono state analizzate per verificare che le strutture di nanotubi a tunnel colorati con F-actina e fosfo-PAK1 fossero condotti di membrana tra le cellule. Le cellule sono state doppiamente immunocolorate con tubulina F-actina e beta III e i nanotubi tunneling F-actina e i condotti a doppia membrana positiva a membrana F-actina e beta III simili a nanotubi tunneling sono stati distinti dai soli nanotubi tunneling F-actina positivi.
I nanotubi tunneling co-espressi con fosfo-PAK1 e F-actina sono stati distinti dalle protrusioni cellulari di altri neuriti costruendo immagini di visualizzazione del volume 3D basate sulla loro caratteristica di librarsi tra due cellule senza toccare il substrato. L'uso del giusto agente fissativo è importante in quanto la fissazione imperfetta del campione può portare a una rapida degradazione proteolitica delle proteine bersaglio e ad una riduzione dell'immunoreattività specifica.
