Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione in vivo e tridimensionale e la quantificazione delle cellule che mantengono l'etichetta della nicchia delle cellule staminali incisive di topo. Questa tecnica consente di risparmiare tempo e di essere facile da usare per i nuovi studenti. Le immagini 3D vengono acquisite senza danneggiare il tessuto.
La quantificazione 3D rende i dati più affidabili e accurati. Per iniziare, seziona le mandibole. Fissare i campioni in paraformaldeide al 4% e tenerli a temperatura ambiente durante la notte.
Dopo l'incubazione, rimuovere i muscoli dalle mandibole. Immergerli in una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico 0,5 molari per decalcificare per quattro giorni con un cambio medio giornaliero su uno shaker a 37 gradi Celsius. Decolorare le mandibole in 15 millilitri di soluzione al 25% Quadrol su uno shaker a 37 gradi Celsius per un giorno per rimuovere l'eme sanguigno rimanente.
Per la colorazione con 5-etinil-2-prime-deossiuridina a montaggio intero, preparare un cocktail fresco di etichettatura 5-etinil-2-prime-deossiuridina come menzionato nel testo. Risciacquare le mandibole con una soluzione salina tamponata con fosfato con Tween 20 o PBST per 30 minuti su uno shaker a 37 gradi Celsius. Ripetere il risciacquo delle mandibole con soluzione salina tamponata con fosfato tre volte per tre minuti ciascuna, seguito dall'incubazione in un cocktail di etichettatura 5-etinil-2-prime-deossiuridina appena preparato su uno shaker durante la notte.
Ripetere il lavaggio salino tamponato con fosfato tre volte ed eseguire la dislipidazione seriale posizionando le mandibole nelle soluzioni menzionate nel testo per sei ore ciascuna in uno shaker a 37 gradi Celsius. Disidratare le mandibole in terz-butanolo-polietilenglicole, o tB-PEG, soluzione per due giorni a 37 gradi Celsius con il cambio giornaliero del mezzo. Dopo due giorni, pulire la mandibola in un mezzo di pulizia benzil benzoato-polietilenglicole contenente il 75% di benzil benzoato, il 22% di polietilenglicole-metil-etere metacrilato medio 500 o PEG-MMA500 e il 3% Quadrol per ottenere la corrispondenza dell'indice di rifrazione e fino al raggiungimento della trasparenza.
Montare l'intera mandibola ripulita dal tessuto su vetrini di cavità di marca nel mezzo di pulizia del glicole benzilbenzoato-polietilenico e coprirlo con vetrini di copertura. Nel software di imaging confocale, impostare i parametri di acquisizione delle immagini desiderati. Nel pannello per l'eccitazione fluorescente, attivare il laser necessario per eccitare i fluorofori in modo ottimale.
Nel pannello per il rilevamento fluorescente, spostare il cursore per selezionare le lunghezze d'onda da misurare. Aggiungere una goccia di olio ad immersione con un indice di rifrazione di 1,52 sulla parte superiore del coprivetrino per abbinare l'indice di rifrazione del vetrino e dell'obiettivo, e posizionare la mandibola montata sul palco del microscopio. Accendi le lampade fluorescenti e scegli un obiettivo di ingrandimento appropriato per l'immagine delle regioni di interesse.
Nella modalità live scan, identifica il campo visivo per visualizzare l'intera regione della mandibola nelle dimensioni X e Y. Impostare i parametri di acquisizione dello stadio Z superiore e inferiore che coprono accuratamente il volume della nicchia delle cellule staminali nell'incisivo dei topi. Utilizzare una dimensione del passo Z di due micrometri o secondo le proprie esigenze.
Acquisisci e salva file immagine Z-stack in formato lif. Utilizzare un convertitore di file software di imaging per convertire il file di immagine Z-stack nel tipo di file in formato nativo. Nel software di imaging, fai clic sul pulsante Arena, quindi scegli Immagine.
Selezionare il file lif originale e scegliere il file unito. Le immagini verranno importate nel software di imaging. Fare doppio clic sul file importato per aprire il set di dati dell'immagine.
Nel software di imaging, visitate il pannello Regolazione schermo. Nel pannello Regolazione schermo, fate clic sul nome del canale. Di solito è etichettato come rosso in modalità predefinita.
Nella finestra Proprietà immagine, fare clic sulla scheda Colore mappato. Nell'opzione File della scheda Colore, scegliere Flusso di fuoco, quindi fare clic su OK. Selezionare il colore del display per distinguere la fluorescenza di fondo e la fluorescenza positiva dal campione. Nella parte superiore sinistra dello schermo, nel riquadro Proprietà scena, fare clic sull'icona blu Aggiungi nuova superficie.
Deselezionate l'icona Volume per rimuovere la maggior parte della fluorescenza di fondo, ottenendo la fluorescenza positiva chiaramente visibile durante la segmentazione manuale. Successivamente, avvia la segmentazione manuale della regione di interesse, o ROI, facendo clic sulla scheda Crea e selezionando la scheda Salta creazione automatica, modifica manuale. Nella procedura guidata di creazione manuale della superficie, fare clic sulla scheda Contorno per scegliere l'orientamento in base ai campioni per contornare facilmente il ROI.
Quindi, assicurati che il menu del puntatore nell'angolo destro sia in modalità Seleziona. Regolare la posizione della fetta per individuare il ROI nel tessuto. Come accennato in precedenza, la maggior parte della fluorescenza di fondo è già stata rimossa.
Fare clic sul pulsante Disegna e disegnare una regione provvisoria di interesse. Seleziona l'opzione Visibilità su Nessuno per evitare interferenze da aree diverse dal ROI, quindi segmenta l'area di interesse sezione per sezione. Al termine del disegno del ROI, fare clic su Crea superficie per ottenere una geometria 3D del ROI.
Fate clic sul pulsante Modifica (Edit) nella procedura guidata di creazione manuale della superficie e selezionate Maschera tutto (Mask All). Nella finestra Canale maschera visualizzata, selezionare Canale 1 nelle opzioni Selezione canale. Successivamente, selezionare Duplica canale prima di applicare la maschera.
Nelle impostazioni della maschera, selezionare Costante interno/esterno e impostare la superficie esterna del voxel su zero. Nel riquadro Proprietà scena, deselezionate l'oggetto Surface e selezionate l'oggetto Volume. In Regolazione schermo, deselezionate il canale rosso originale e selezionate il canale rosso mascherato.
E regola le intensità del colore per ottenere il ROI di fluorescenza desiderato reso in 3D e etichettato positivamente. Creare un nuovo oggetto Spot facendo clic sull'icona Spot per quantificare le celle di conservazione delle etichette renderizzate in 3D creando punti 3D che si sovrappongono in modo comparabile alle celle di conservazione delle etichette renderizzate in 3D. Utilizzare le frecce inferiori per spostarsi tra i passaggi della procedura guidata di creazione spot.
Fare clic sul pulsante Fine e selezionare il pulsante Statistiche. Quindi, seleziona la scheda Generale per trovare il valore del numero totale di punti nell'immagine. Dopo la marcatura con 5-etinil-2-prime-deossiuridina e il processo di pulizia dei tessuti del sistema solvente associato al glicole polietilenico, è stata ottenuta la mandibola trasparente.
Il campione modificato è stato confrontato con una mandibola normale senza un processo di pulizia dei tessuti e una mandibola trasparente con marcatura con 5-etinil-2-prime-deossiuridina è stata sottoposta a imaging confocale. La sezione ottica dell'incisivo mostrava cellule che conservavano l'etichetta nella nicchia delle cellule staminali dell'apice dell'incisivo nel piano XY. La costruzione dell'immagine 3D di un apice incisivo ha mostrato cellule staminali quiescenti positive per l'etichetta 5-etinil-2-prime-deossiuridina che mantengono l'etichetta sia nella nicchia delle cellule staminali epiteliali che in quella mesenchimale.
Le cellule positive alla 5-etinil-2-prime-deossiuridina sono state trasferite in punti per la quantificazione che si sovrapponevano in modo comparabile alle cellule mesenchimali che conservano l'etichetta. Le macchie create solo per le cellule mesenchimali che conservano l'etichetta e solo per le cellule epiteliali che conservano l'etichetta sono visibili nell'immagine. È stata inoltre eseguita la quantificazione delle cellule epiteliali e mesenchimali che mantengono l'etichetta.
Le proprietà per la lavorazione e la pulizia sono i passaggi più importanti e dovrebbero essere ottimizzati in base all'uso del tessuto per ottenere risultati soddisfacenti. Questo metodo può anche essere modificato per visualizzare LRC a livello di S2VGFP e nel tracciamento della linea cellulare per ottenere dettagli sulla posizione della progenie e sulla loro quantificazione o contributi.
