Abbiamo affrontato gli stati d'animo di attivazione e ricalcolo del farmaco di S1PRS da parte dell'equipaggio, le manipolazioni EM e lo stato di inhab GI A M P A e basi meno significative per lo sviluppo di un farmaco che mira solidamente a S1PRS I progressi rendono possibile virulizzare i sottodipinti ingranditi della stimolazione o dell'abitazione di GP ZR e ulteriori benefici nello scoprire i normali siti di legame per la creazione di farmaci mirati a T BCR. La qualità del campione è la base per tutto Nell'esperimento EM corretto. I fattori essenziali per una preparazione semplice includono vari stati del prodotto della vendita della linea SF e una concentrazione N g A dimostrare la procedura sarà Heli Wang uno studente laureato dal mio livello.
Per il carico di purificazione delle proteine questa scena del dito uno recettori fosfato o S uno P R S G soluzione complessa proteica ad una cromatografia di esclusione dimensionale o colonna di filtrazione gel S E C pre equilibrata con tampone S E C ad una portata di 0,5 millilitri al minuto a quattro gradi Celsius. Per utilizzare le frazioni raccolte per la microscopia crioelettronica, concentrarle usando un concentratore di taglio da 100 kilodalton a 1.300 XG a quattro gradi Celsius. Durante l'elaborazione dei dati per la classificazione 2D nella classificazione preliminare delle particelle, scegliere la funzione di classificazione 2D nel software Rely On e fare clic su Sfoglia a destra del file stella delle immagini di input nell'opzione IO.
Quindi scegli particles.star. Quindi, nell'opzione di ottimizzazione, impostare il numero di classi su 100 e il diametro della maschera A su 140. Nell'opzione di calcolo, impostare il numero di particelle raggruppate su 10 e immettere la directory da un'unità locale veloce e veloce nel campo della directory copia particella a scratch.
Per un'elaborazione più rapida, selezionare sì per l'accelerazione GPU utilizzata. Per la selezione di sottoinsiemi di buoni risultati 2D come modelli, vai all'opzione IO della funzione di selezione dei sottoinsiemi e fai clic su sfoglia a destra delle classi selezionate da model.star. Quindi, scegli run_it025_model.
Stella come input e fare clic su Esegui nella finestra pop-up Seleziona ordina immagini su e invertire l'ordinamento. Quindi fare clic su display. Dopo aver scelto buoni risultati 2D rappresentativi come riferimento per la funzione di selezione automatica, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Salva classi selezionate.
Per utilizzare il modello per il secondo round di prelievo automatico, vai all'opzione IO della funzione di prelievo automatico. Fare clic su Sfoglia a destra delle micrografie di input per il prelievo automatico e scegliere micrographs.star. Quindi fare clic su Sfoglia a destra dei riferimenti 2D e scegliere class_averages.star.
Inoltre, selezionare no per o utilizzare leplossian in di Gaussian. Quindi, eseguire l'estrazione delle particelle utilizzando il suffisso underscore del cordone underscore auto pick.star. Eseguire la classificazione 2D utilizzando le particelle.
stella, seguita dalla selezione del sottoinsieme utilizzando run sottolineano zero 20 five_optimizer. stella Per l'estrazione delle particelle, dopo aver fatto clic su Sfoglia a destra del file a stella della micrografia nell'opzione IO, scegliere micrografie. Stella e selezionare Sì per o Estrai nuovamente particelle raffinate.
Dopo aver fatto clic su Sfoglia a destra del file a stella delle particelle raffinate, selezionare le particelle. stella per generare un modello 3D iniziale e una mappa di riferimento, fare clic su sfoglia del modello iniziale 3D a destra del file stella delle immagini di input nell'opzione IO e scegliere il particles.star precedente. Quindi, nell'opzione di ottimizzazione, impostare il numero di classi su uno e il diametro della maschera A su 140.
Per la classificazione 3D e la generazione di una mappa 3D preliminare, dopo aver selezionato le particelle. Come illustrato in precedenza, fare clic su Sfoglia a destra della mappa di riferimento e scegliere Initial Underscore Model dot MRC. Quindi, nell'opzione di ottimizzazione, impostare il numero di classi da quattro a sei e il diametro della maschera A su 140.
Per la generazione della maschera, dopo aver selezionato una buona mappa 3D come input nell'opzione IO, impostare la soglia di binarizzazione iniziale su 0,05 e la mappa binaria estesa a questo numero di pixel su tre. Quindi, vai all'opzione maschera e imposta. Aggiungi un bordo morbido a questo numero di pixel fino a otto.
Per l'elaborazione successiva, apri il software Trino Spark, crea una nuova area di lavoro e fai clic su job builder per il primo lavoro. Per importare la pila di particelle, immettere il percorso della particella nel campo del meta percorso delle particelle e il percorso dei filmati nel campo del percorso dei dati delle particelle. Quindi, importare i volumi 3D immettendo il percorso del miglior volume 3D generato in precedenza nel percorso dati del volume e selezionando la maschera per il tipo di volume da importare.
Per un perfezionamento non uniforme, trascinate le particelle di sottolineatura importate generate in precedenza come input della particella delle particelle di perfezionamento non uniforme. Volume di sottolineatura importato, sottolineatura uno come input del volume di perfezionamenti non uniforme e maschera di sottolineatura importata sottolineano uno come input della maschera di perfezionamento non uniforme. Maschera. Quindi, fare clic su Q per avviare l'elaborazione e ripetere la procedura per ottenere una buona risoluzione.
S1PRGI 3D mappa. Dopo la costruzione del plasmide e la preparazione per la trasfezione transitoria, aggiungere due microgrammi di DNA preparato in 200 microlitri di tampone reagente di trasfezione. Mescolare vorticando per 10 secondi e girando brevemente il composto prima dell'uso.
Aggiungere quattro microlitri di reagente di trasfezione e mescolare per vortice e rotazione come dimostrato in precedenza. Dopo aver incubato il tubo a temperatura ambiente per 15 minuti, far cadere lentamente 200 microlitri della miscela di trasfezione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente CHOK una cella e agitare delicatamente la piastra o la miscelazione accurata. Dopo quattro-sei ore di incubazione, sostituire il mezzo di trasfezione con il mezzo di crescita cellulare costituito da F 12 medio e 10% fbs prima di restituire la piastra all'incubatore.
Da 24 a 48 ore dopo la raccolta delle cellule in transezione, sospendere le cellule in tre millilitri di un tampone SA con sale di potassio luciferino D. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 90 microlitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti mescolata delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Per la determinazione del segnale di fluorescenza, in primo luogo, preparare 10 millimolari di soluzioni madre di siponimod in D M S O.Quindi effettuare una diluizione seriale in tampone H B S S contenente 25 micromolari forscalina e stimolare le cellule con 10 microlitri di varie concentrazioni di questa soluzione agonista per 30 minuti.
Quindi, contare il segnale di luminescenza in un lettore di micropiastre selezionando la luminescenza per il metodo di rilevamento. Endpoint per il tipo di lettura e fibra di luminescenza per il tipo di ottica nel software associato. Inoltre, impostare il guadagno ottico su 255.
Quindi importare i valori del segnale di fluorescenza ottenuti in un programma di foglio di calcolo ed elaborare i dati utilizzando la funzione di risposta alla dose di adattamento della curva di regressione non lineare. Il complesso S1PRS GI potrebbe essere purificato con successo mediante cromatografia ad esclusione dimensionale, che è stata verificata dalla pagina SDS. Inoltre, il protocollo di microscopia elettronica seguito in questo studio è stato efficace nel differenziare tra particelle S1PRSGI con classi 2D chiare e ben definite e particelle di scarsa qualità.
Inoltre, una mappa al microscopio elettronico di S1PR3 GI con una buona risoluzione potrebbe essere generata dalla correlazione del guscio più peloso attraverso un raffinamento non uniforme. Dopo l'analisi strutturale, sono stati eseguiti saggi funzionali per S uno P R tre mediante trasfezione di cellule C H O K one con plasmidi recettore e sensore, che hanno rivelato che il rapporto plasmide recettore/plasmide sensore di uno a tre produce risultati ottimali. Tuttavia, i risultati sono stati meno realistici in heck 2 93 cellule In tale elaborazione, la scelta degli algoritmi nella sezione delle particelle e nella sezione della classificazione 2D e 3D è importante per risolvere i complessi proteici così MPS G, in particolare per modellare le perdite e gli ecfs.
