Questo protocollo descrive due strategie di integrazione lipidica con una combinazione di analisi longitudinale e trascrizionale nell'organismo modello, C.elegans. La tecnica descrive come esaminare i cambiamenti trascrizionali usando pochi vermi o tessuti di vermi sezionati e come l'alimentazione liquida per una popolazione di insetti potrebbe essere accoppiata con tecniche idro. Gli individui che eseguono questa tecnica devono praticare la dissezione dei tessuti a causa della breve finestra temporale per eseguire l'esperimento per ottenere un'adeguata analisi trascrizionale.
Per iniziare, raccogliere i batteri OP50 centrifugando la coltura coltivata durante la notte a 4.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Sospendere il pellet batterico in 20 millilitri di diluizione batterica, restrizione dietetica o base BDR mediante vortice e ripetere nuovamente la centrifugazione per 10 minuti.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet batterico nel mezzo BDR per preparare uno stock batterico 20 X BDR. Diluire il brodo batterico a 5X utilizzando un mezzo BDR prima dell'uso. Utilizzando etanolo o dimetilsolfosfordo come solvente, preparare una soluzione madre lipidica in un nuovo flaconcino di vetro autoclavato e riempire il flaconcino di vetro con argon o azoto per prevenire l'ossidazione.
Trasferire la soluzione di brodo lipidico alla soluzione di batteri BDR per ottenere la concentrazione finale desiderata in condizioni di alimentazione. Mescolare accuratamente vorticando per 20 secondi. Preparare il veicolo controllato mescolando gli stessi volumi di etanolo filtrato o dimetilsolfosfordo con batteri BDR.
Eseguire l'integrazione lipidica e la coltura liquida trasferendo la quantità desiderata di lipidi o controllo del veicolo a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con tre o quattro repliche per ogni condizione di alimentazione. Mescolare la sospensione sincronizzata di vermi Caenorrhabditis elegans con batteri BDR 5X in un rapporto uno a uno per ottenere una concentrazione finale di 1.500 vermi per millilitro e 2,5X per i batteri. Quindi trasferire due millilitri della miscela di batteri vermi a ciascun pozzetto della piastra del pozzetto 12.
Al termine, avvolgere la piastra a 12 pozzetti con un foglio e agitare la piastra in un'incubatrice a 20 gradi Celsius a 100 RPMM per la lunghezza di incubazione desiderata. Per l'integrazione lipidica su piastre, seminare un millilitro di batteri lipidici condizionati al centro di un mezzo di crescita nematode di 10 centimetri o piastra di agar NGM. Assicurarsi che la soluzione di lavoro finale sia vorticata più volte tra la semina delle due piastre quando si lavora con un numero elevato di piastre.
Asciugare la piastra al buio all'interno di un cappuccio di biosicurezza. Trasferire 3000 vermi dalla coltura di vermi sincronizzata alla piastra da 10 centimetri. Asciugare la piastra in un cappuccio di biosicurezza fino a quando i vermi che nuotavano sulle piastre integrate con lipidi, iniziano a strisciare.
Una volta essiccata, incubare la piastra climatizzata dai lipidi in un incubatore a 20 gradi Celsius per il periodo di tempo desiderato e, se si utilizzano lipidi polinsaturi, proteggere la piastra dalla luce. Preparare 20 microlitri di soluzione di lisi finale per ciascun campione mescolando 0,2 microlitri di DNasi I con 19,8 microlitri di soluzione di lisi in una provetta PCR e mescolare bene pipettando su e giù cinque volte. Per estrarre l'RNA dal piccolo numero di vermi interi, rimuovere i batteri trasferendo da 15 a 20 vermi dal prato batterico a una piastra NGM appena non seminata.
Trasferire da 15 a 20 vermi dalla piastra NGM non seminata alla provetta PCR contenente 20 microlitri della soluzione di lisi finale appena preparata con il numero minimo di batteri e incubare la reazione di lisi per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta terminata l'incubazione, conservare il campione in un bel bagno di acqua fredda e sondare sonicare i vermi quattro volte, cinque secondi ogni volta con il 30% di ampiezza e pulsare per 15 secondi tra ogni momento di sonicazione. Incubare il tubo a temperatura ambiente per cinque minuti prima di aggiungere due microlitri di soluzione di arresto nella reazione di lisi e mescolare picchiettando delicatamente.
Incubare la reazione per due minuti a temperatura ambiente e quindi impostare il tubo sul ghiaccio. Per estrarre l'RNA dal tessuto del verme, raccogliere circa 20 vermi dal prato batterico e metterli in una piastra NGM fresca non seminata per rimuovere i batteri dai vermi. Trasferire 20 vermi con il minor numero possibile di batteri in un vetro da orologio contenente 500 microlitri di soluzione di M9 contenente quattro levamisole micromolare.
Quando i vermi sono immobilizzati, sezionare la linea germinale o l'intestino usando un ago di calibro 25 che può essere attaccato alla siringa da un millilitro. Utilizzando una pipetta di vetro autoclavata, trasferire i tessuti sezionati nel tubo PCR e depositare il tubo sul ghiaccio per due minuti consentendo la deposizione del materiale sul fondo. Rimuovere il surnatante dal tubo PCR prima di aggiungere 20 microlitri di soluzione di lisi finale e mescolare bene picchiettando.
Dopo aver incubato la reazione di lisi per cinque minuti, aggiungere due microlitri di soluzione di arresto e picchiettare il tubo più volte. Incubare la provetta per due minuti prima di procedere alla trascrizione inversa. Nello studio di validazione, l'RNA estratto da una vasta popolazione e da alcuni vermi ha mostrato un'induzione simile dei geni di elaborazione dei neuropeptidi, egl-3 ed egl-21.
Suggerisce che l'estrazione dell'RNA da alcuni vermi può essere una valida alternativa alle tecniche standard di sintesi del CDNA da grandi popolazioni. Nell'intestino sezionato dei vermi transgenici lipl-4, integrati con acido diomo-gamma-linolenico, o DGLA, i geni di elaborazione neuropeptidica neuronale non sono stati indotti. L'integrazione di DGLA a diverse concentrazioni ha salvato l'estensione della durata della vita nei vermi dopo l'abbattimento di grasso-3.
I vermi con supplementazione lipidica possono anche essere elaborati per il sequenziamento dell'RNA, la proteomica, la metabolomica e gli studi comportamentali per identificare ulteriori fenotipi in queste condizioni specifiche. Questa metodologia può essere applicata alla ricerca sull'invecchiamento, alla biologia lipidica e a qualsiasi altra area di ricerca che mira a stabilire una relazione tra un determinato fenotipo e un fattore nutrizionale o metabolita.
