Il sistema di saggio di trascrizione in vitro per Borreliella burgdorferi fornisce uno strumento biochimico per i ricercatori per studiare i meccanismi di regolazione genica e i fattori che governano l'attività enzimatica della RNA polimerasi. Il sistema ci consente di testare come i fattori di trascrizione, i cofattori, le concentrazioni di sale e il pH influiscono sulla funzione della Borreliella burgdorferi RNA polimerasi, che contribuisce alla nostra comprensione complessiva dei meccanismi di regolazione genica. Questa potente tecnica può anche permetterci di selezionare farmaci che inibiscono selettivamente la RNA polimerasi, aprendo la porta allo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento della borreliosi di Lyme.
Per iniziare, raccogliere il pellet cellulare da due a quattro litri di Borreliella burgdorferi RpoC-His10X coltivato in mezzo BSKII in un ambiente microaerofilo ad una densità da due a quattro volte 10 costante per millilitri. Pellet le celle a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius in bottiglie centrifughe da 500 millilitri e scartare il surnatante. Quindi, risospendere le cellule in 30 millilitri di tampone HN ghiacciato, ripetere la fase di centrifugazione e decantare il surnatante.
Durante il lavoro, mantenere le cellule, lisato e proteine purificate a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio a meno che non si congeli. Mantenere la RNA polimerasi in un ambiente riducente aggiungendo ditiotreitolo appena preparato ad una concentrazione di due millimolari a ciascun tampone utilizzato e mantenere il pH 8,0. Preparare il lisato dal pellet cellulare Borreliella burgdorferi utilizzando un kit di lisi batterica commerciale.
Risospendere il pellet in 10-15 millilitri di soluzione di B-PER senza inibitore della proteasi e lasciare che la lisi proceda per cinque minuti su ghiaccio. Aggiungere un cocktail di inibitori della proteasi alla soluzione di lisi e procedere con tre cicli di sonicazione. Ora chiarisci il lisato cellulare mediante centrifugazione e filtrazione utilizzando una provetta da centrifuga da 50 millilitri.
Aggiungere il buffer di caricamento della colonna di cobalto alla soluzione, rendendo il volume totale fino a 30 millilitri. Pellet i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 volte G per 30 minuti. Successivamente, filtrare il surnatante utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri e diluire il tampone di carico a colonna di lisato e cobalto fino a un rapporto di diluizione finale di 1:10.
Eseguire la cromatografia di affinità sul surnatante di lisato cellulare chiarificato utilizzando una colonna di resina di cobalto o nichel seguendo le istruzioni del produttore. Salvare i campioni di flusso, lavaggio ed eluizione per l'analisi. Sostituire immediatamente la soluzione tampone della soluzione di RNA polimerasi con la soluzione tampone di stoccaggio utilizzando una colonna di scambio tampone seguendo le istruzioni del produttore.
Quindi, concentrare la RNA polimerasi a una concentrazione da 0,2 a 0,4 milligrammi per millilitro utilizzando unità filtranti centrifughe da 10 kilodalton. Determinare la concentrazione mediante spettrofotometro e preparare le scorte di congelamento. Aliquot da 20 a 50 microlitri di volumi di RNA polimerasi congelano le scorte in provette per PCR e immagazzinano la RNA polimerasi a meno 80 gradi Celsius.
Preparare le superfici di lavoro, compreso il banco di radiazione, per ridurre la contaminazione da radiazioni. Scongelare le scorte di RNA polimerasi fresca e RpoD sul ghiaccio e mescolare accuratamente tutte le scorte congelate scongelate prima del pipettaggio Preparare una miscela di reazione principale in una miscela NTP separata per nucleotidi radiomarcati secondo i requisiti sperimentali. Erogare le reazioni di controllo in set sperimentali in provette per PCR.
Dopo aver erogato acqua, miscela di reazione, RNA polimerasi e RpoD in provette PCR designate, mescolare i reagenti mediante pipettaggio. Trasferire i materiali preparati in un banco di radiazioni, aggiungere ATP marcato con alfa-32P a NTP e mescolare mediante pipettaggio delicato. Aggiungere NTP alle provette contenenti le miscele di reazioni di trascrizione in vitro e avviare la reazione di trascrizione in vitro aggiungendo un modello di DNA.
Mescolare il volume di reazione pipettando delicatamente e incubare i tubi a 37 gradi Celsius per cinque minuti in un termociclatore o in un blocco termico. Rimuovere le reazioni dal termociclatore o dal blocco termico e interrompere le reazioni di trascrizione in vitro aggiungendo un volume uguale di colorante di carico di RNA 2X contenente il 50% di formammide alla miscela di reazione. Denaturazione degli enzimi mediante incubazione di reazioni a 65 gradi Celsius per cinque minuti in un termociclatore o blocco termico.
Utilizzando l'elettroforesi su gel, separare l'RNA trascritto in vitro in gel di poliacrilammide urea dal 10% al 15% a 180 volt per 30-45 minuti. Dopo aver rimosso qualsiasi porzione del gel contenente ATP radiomarcato non incorporato, esporre il gel allo schermo fosfo durante la notte e visualizzare l'RNA radiomarcato utilizzando un imager fosfoscreen. La SDS-PAGE ha mostrato tre bande corrispondenti a tre peptidi, RpoC, RpoB e RpoA del complesso RNA polimerasi.
È stato anche osservato un peptide di 115 kilodalton corrispondenti alle dimensioni del RpoD ricombinante Borreliella burgdorferi marcato con MBP. La scissione della miscela proteica con il fattore XA proteasi ha portato alla generazione di due prodotti significativi, RpoD e MBP. Il sito promotore di Borreliella burgdorferi FLGB è stato generato da PCR.
Una doppia diluizione della concentrazione di RpoD dà luogo a un livello inferiore del prodotto di RNA accumulato. Una bassa concentrazione di RNA polimerasi fornisce meno prodotti di RNA in tutta la gamma di concentrazioni di RpoD. Il segnale densitometrico ha indicato una relazione lineare tra la quantità di RpoD presente nella reazione in entrambi gli esperimenti.
L'attività enzimatica della RNA polimerasi è sensibile a una varietà di fattori durante il processo di purificazione, stoccaggio e sperimentazione. Enzimi e reagenti freschi, insieme a una buona pianificazione, offrono le migliori possibilità di successo in questo protocollo.
