Questo protocollo può aiutare a comprendere i meccanismi coinvolti nella regolazione di KCC2 valutando direttamente la sua fosforilazione molecolare della chinasi, facendo così luce sulle sue funzioni e attività fisiologiche. Può essere usato per identificare e caratterizzare molecole come proteine di interesse da miscele complesse di molecole correlate anche quando un'espressione proteica è molto piccola. La tecnica è uno strumento essenziale per l'analisi proteica di sistemi complessi e l'identificazione di potenziali meccanismi alla base della funzione o della malattia del tessuto aberrante.
A dimostrare le procedure sarà Sunday Solomon Josiah, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Inizia pre-armando tutti i reagenti nel bagno di perline a 37 gradi Celsius e scongelando completamente le cellule del rene embrionale umano KCC2b 293 del ratto stabilmente transettato completamente nel bagno di perline. Quindi trasferire le cellule dal tubo del flaconcino criogenico in una provetta da centrifuga contenente cinque millilitri di mezzi freschi e centrifugare le cellule a 1.200 G per tre-cinque minuti.
Dopo aver aspirato il surnatante utilizzando una pipetta aspiratore fissata a una pompa per vuoto, risospendere le celle in 10 millilitri di mezzi freschi. Trasferire la sospensione su un piatto piatto di 10 centimetri e lasciarla crescere per 48 ore in un'incubatrice con temperatura di 37 gradi Celsius e anidride carbonica del 5%. Una volta che le cellule raggiungono il 90% di confluenza, dividerle aspirando i vecchi mezzi e sciacquandoli con due millilitri di PBS.
Aggiungere due millilitri di tripsina e incubarli per circa uno o due minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule tripsinizzate usando due millilitri del mezzo completo. Aggiungi nove millilitri di supporti freschi ai nuovi piatti.
Quindi aggiungere un millilitro di soluzione dal vecchio piatto al nuovo piatto. Trasferire i piatti a cellule divise nell'incubatrice per 48 ore per ottenere una confluenza superiore al 90%. Trattare le cellule con dimetilsolfossido, otto staurosporine micromolari o 0,5 millimolari di N-etilmaleimmide per 15 minuti prima della raccolta in tampone di lisi.
Aspirare il supporto dal piatto di coltura transettato, posizionare i piatti di coltura sul ghiaccio e lavare le cellule con PBS ghiacciato. Aspirare il PBS e aggiungere 1,0 millilitri di tampone di lisi ghiacciato al piatto. Dopo aver raschiato le cellule dal fondo del piatto utilizzando un raschietto a celle di plastica fredda, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga posto sul ghiaccio, seguito da agitazione costante per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver centrifugato i lisati cellulari in una centrifuga fredda, metterli su ghiaccio. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco pre-raffreddato e scartare il pellet. Pipettare 300 microlitri di Protein G Sepharose in una provetta per microcentrifuga.
Quindi centrifugare la soluzione a 500 G per due minuti. Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di PBS e vortice. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione e ripetere il passaggio.
Quindi, mescolare un milligrammo di anticorpi anti-KCC2 treonina 906 e anti-KCC2 treonina 1007 con 200 microlitri di perle di proteina G sepharose prima di aumentare il volume a 500 microlitri con PBS. Dopo aver agitato su una piattaforma vibrante o ruota rotante per due ore a quattro gradi Celsius, ripetere due lavaggi con PBS. Effettuare la quantificazione delle proteine sui lisati cellulari e aggiungere un milligrammo di lisato cellulare alle perle lavate e incubare in un rotatore end-to-end prima di girare verso il basso.
Somministrare tre lavaggi con PBS contenente cloruro di sodio 150 millimolare, seguiti da tre lavaggi con 200 microlitri di PBS prima di risospendere il pellet finale in 100 microlitri di tampone campione LDS. Agitare i tubi in uno shaker a rotore a temperatura ambiente per cinque minuti. Incubarli in un blocco riscaldante e centrifugarli prima di utilizzare il surnatante per il carico di gel.
Assemblare l'apparecchio di colata Western Blot e versare il gel separatore 8% appena preparato per colare il gel, lasciando circa due centimetri di spazio dalla parte superiore del vetro di fusione. Aggiungere 200 microlitri di isopropanolo assoluto alla configurazione e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 60 minuti. Rimuovere l'isopropanolo usando una pipetta e sciacquare accuratamente il gel con circa 200 microlitri di acqua distillata.
Dopo aver aggiunto il gel impilante al 6% appena preparato alla configurazione di fusione, inserire delicatamente il pettine e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi fissare il gel fuso nel serbatoio di elettroforesi. Dopo aver versato il tampone corrente nel serbatoio, caricare cinque microlitri di marcatore di peso molecolare nel primo pozzetto e una quantità uguale di proteine in ciascun pozzetto del gel SDS-PAGE.
Riempire i pozzetti vuoti con LDS e far funzionare il gel per circa 90-120 minuti a 120 volt. Reidratare la membrana nitrocellulosa con tampone di trasferimento contenente il 20% di metanolo. Risciacquare il gel e la membrana con il tampone di trasferimento e distribuirli delicatamente sulla pila di preparazione.
Disporre il sandwich da trasferire in questo ordine: elettrodo negativo, schiuma sandwich, gel SDS-PAGE risciacquato con carta da filtro, membrana nitrocellulosa risciacquata, carta da filtro, schiuma sandwich, elettrodo positivo. Una volta fatto, impilare il sandwich assemblato nel serbatoio di trasferimento e correre a 90 volt per 90 minuti o 30 volt per 360 minuti. Bloccare la membrana asciutta per un'ora a temperatura ambiente utilizzando un tampone bloccante.
Incubare le membrane con opportune diluizioni di anticorpi primari e beta-actina in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi somministrare tre lavaggi di TBST per cinque minuti ciascuno. Incubare la membrana lavata con un anticorpo secondario diluito in un tampone bloccante per 60 minuti e ripetere tre lavaggi di TBST.
Una volta fatto, posizionare la membrana lavata sulla scheda di imaging. Per sviluppare i segnali, diffondere la soluzione preparata mescolando volumi uguali di ciascun reagente di chemiluminescenza potenziato sulla membrana prima di trasferire la scheda di imaging al sistema di imaging per l'imaging. Il trattamento delle cellule HEK293 con staurosporina e N-etilmaleimide o NEM ha causato una diminuzione della fosforilazione nei siti bersaglio SPAK, treonina 233 situata nel dominio della chinasi T-loop e serina 373 del sito di fosforilazione S-loop di SPAK espresso endogenamente.
La staurosporina ha ridotto la fosforilazione della serina 940 nelle cellule HEK294 che esprimono stabilmente KCC2b, ma NEM ha aumentato significativamente la sua fosforilazione. Inoltre, la staurosporina diminuisce la fosforilazione nel sito treonina 505, mentre NEM ha causato un leggero ma insignificante aumento della fosforilazione nello stesso sito. Gli effetti differenziali di entrambi i composti sulla fosforilazione della proteina chinasi C nel sito treonina 505 e KCC2b nel sito serina 940 sono ben correlati.
Il risultato rappresentativo ha anche mostrato che NEM ha causato un aumento significativo dell'espressione della quantità totale di KCC2, mentre l'espressione del totale NKCC1 e SPAK non è stata significativamente modificata quando trattati con entrambi i composti. Inoltre, i due composti hanno causato una diminuzione della fosforilazione di SPAK nei siti treonina 233 e serina 373, e questo è correlato rispettivamente con la fosforilazione abbreviata della treonina 906/1007 e della treonina 203/207/212 e dell'espressione endogena di NKCC1. Inoltre, staurosporina e NEM hanno ridotto e aumentato la fosforilazione della proteina chinasi C nel sito di serina 940 e hanno espresso stabilmente KCC2b rispettivamente, che è correlato con la riduzione e l'incremento della fosforilazione della proteina chinasi C delta nel sito treonina 505 dopo il trattamento rispettivamente con staurosporina e NEM.
Se viene utilizzato un anticorpo primario o secondario improprio, la banda non verrà vista durante l'imaging. Inoltre, il segnale potrebbe non essere visibile se viene utilizzata una concentrazione troppo bassa di anticorpi. La tecnica è uno strumento rilevante nell'analisi quantitativa delle proteine e ne ha permesso l'uso per molti scopi scientifici e di risorse, anche come efficace strumento diagnostico precoce.
