Il nostro protocollo consente la visualizzazione del metabolismo spaziale delle interazioni microbiche che si verificano durante l'infezione. Abbiamo sviluppato questo flusso di lavoro di spettrometria di massa per immagini per co-colture batteriche coltivate su modelli di agar e tessuti. L'analisi di substrati non tradizionali come le colture batteriche coltivate su agar presenta molte sfide.
Utilizzando il nostro protocollo, i campioni batterici possono essere opportunamente essiccati per facilitare l'applicazione della matrice MALDI nelle successive analisi di spettrometria di massa per immagini. Questo metodo è ampiamente applicabile a una varietà di metaboliti, patogeni microbici o malattie e tipi di campioni in cui è richiesta una misura spaziale della biochimica cellulare o tissutale, in particolare quando si studiano tipi di campioni che richiedono disidratazione prima dell'analisi. Dopo aver preparato le macrocolonie di coltura batterica, rimuovere le colonie batteriche di agarosio montate su vetrini da microscopio rivestiti con ITO dal materiale di imballaggio.
Mettere i campioni in una scatola asciutta con essiccante per 48-72 ore a temperatura ambiente. Ispezionare visivamente le colonie per le deformazioni nella superficie dell'agar. Quindi, chiudere la linea del vuoto nella camera di campionamento e accendere l'interruttore di alimentazione della pompa rotativa a palette per consentire alla pompa per vuoto di riscaldarsi e ottenere la corretta pressione del vuoto.
Accendere il trasformatore a tensione variabile per riscaldare il filamento di filo avvolto attorno alla camera. Regolare l'alimentazione variabile fino a quando la temperatura interna della camera a vuoto raggiunge circa 50 gradi Celsius. Mentre la pompa si sta riscaldando, posizionare un impasto di ghiaccio secco e etanolo al 100% nel condensatore della trappola fredda.
Aprire la camera a vuoto utilizzando una chiave per allentare i morsetti a flangia a doppio tessuto da 16 millimetri. Inserire i campioni di agarosio nella camera e sigillare saldamente la camera con i morsetti a flangia a doppio tessuto da 16 millimetri. Quindi aprire la valvola della pompa per evacuare la camera e lasciare asciugare i campioni per 60-120 minuti.
Al termine, sfiatare lentamente la camera a vuoto a pressione ambiente chiudendo la valvola sulla pompa rotativa a palette e aprendo la flangia del vuoto all'aria ambiente. Aprire la camera come dimostrato in precedenza e rimuovere il campione di agarosio essiccato dalla camera. Utilizzare la matrice MALDI 1, 5-Diaminonaftalene per il suo favorevole desorbimento e ionizzazione degli amminoacidi e la modalità di ioni negativi.
Attaccare il campione al vassoio dello spruzzatore e caricare le soluzioni preparate nella linea dello spruzzatore. Utilizzando il software del computer, specificare i parametri necessari per un rivestimento uniforme del composto della matrice. Monitorare la sequenza di spruzzatura fino al termine.
Rimuovere il campione dal vassoio dello spruzzatore e conservarlo in un armadio di essiccazione fino all'analisi. Inserire il campione rivestito di matrice nell'adattatore per vetrino per microscopio a piastre target MALDI. Inscrivi almeno tre marcatori fiduciali che racchiudono l'area del campione utilizzando marcatori permanenti.
Utilizzare uno scanner piano per acquisire un'immagine ottica del vetrino del microscopio, compresi i marcatori fiduciari. Ora definisci un metodo di strumento di spettrometria di massa come descritto nel manoscritto. In modalità ioni negativi, selezionare la finestra di massa di 100 dalton dalla massa per carica da 100 a 200 per l'arricchimento del segnale in fase gassosa utilizzando un approccio di accumulo continuo di ioni selezionati che comprende i valori di massa per carica dei metaboliti di interesse.
Aprire il software di acquisizione delle immagini dello strumento e utilizzare la procedura guidata di configurazione per definire il nome e la posizione del file, la modalità di acquisizione MS, le regioni di interesse da campionare e la risoluzione spaziale dell'immagine. Insegnare il campione utilizzando i marcatori fiduciali dell'immagine ottica per sincronizzarlo con il supporto del campione dello strumento. Quindi definire le regioni di interesse sull'immagine ottica utilizzando lo strumento di selezione delle regioni di interesse del software.
Una volta definiti tutti i parametri, avviare la sequenza di acquisizione per acquisire in serie uno spettro di massa in ogni pixel attraverso la regione di interesse definita. Dopo l'acquisizione delle immagini, salvare i dati con un'estensione di file MIS che è un formato di file specifico del fornitore per le piattaforme di spettrometria di massa di imaging. Aprire il file di dati in pacchetti software flexImaging o SCiLS oppure esportare in un formato di dati non proprietario come mzML e visualizzarlo utilizzando software indipendente dal fornitore.
Utilizzando il software di riferimento, definire finestre di massa per i picchi di interesse per generare mappe di calore a falsi colori delle distribuzioni ioniche attraverso le regioni campionate. Sulla visualizzazione media dello spettro di massa, ingrandire il picco di interesse e selezionare una finestra di massa appropriata che comprenda l'area del profilo del picco. Ora, fai clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di massa evidenziata e seleziona Aggiungi filtro di massa.
Etichettare la massa selezionata in base al valore di carica utilizzando l'identificazione provvisoria del metabolita sospetto come determinato dalla misurazione accurata della massa ad alta risoluzione. Selezionare la soglia di intensità per regolare la gamma dinamica dell'immagine dell'analita visualizzata dalla mappa termica a falsi colori. Regolare ulteriormente i parametri di filtraggio di massa in modo che la finestra di massa comprenda l'area del profilo di picco, quindi aggiungere il filtro di massa.
Pulire tutte le apparecchiature di criosezione risciacquandole con etanolo al 100% e lasciare asciugare prima di posizionare i campioni nella camera del criostato. Preparare vetrini da microscopio rivestiti con ITO utilizzando un ohmmetro per identificare il lato del vetrino con il rivestimento conduttivo. Utilizzando uno scriba con punta di diamante, incidere ed etichettare il lato rivestito di ITO del vetrino del microscopio.
Quindi eseguire la criosezione su un criomicrotomo di ricerca. Trasferire i tessuti ceca di topo incorporati in OCT da un congelatore a 80 gradi Celsius alla camera di criomicrotomo su ghiaccio secco. All'interno della camera del criomicrotomo, montare il tessuto incorporato nell'OCT su un mandrino campione utilizzando una soluzione OCT aggiuntiva.
Dopo che la soluzione OCT si è solidificata, fissare il mandrino alla testa del campione e iniziare la criosezione con incrementi di 10-50 micrometri per raggiungere la profondità o il piano del tessuto desiderato dell'organo. Una volta raggiunta una sezione trasversale ottimale del tessuto, iniziare a raccogliere sezioni a 12 micrometri di spessore. Manipolare delicatamente la fetta usando pennelli artistici e posizionarla su un vetrino da microscopio rivestito in teflon.
Per prelevare il tessuto dal vetrino rivestito in teflon, arrotolare il vetrino del microscopio rivestito ITO sulla parte superiore della sezione di tessuto. Montare la sezione di tessuto sul vetrino del microscopio premendo il palmo sul retro del vetrino rivestito ITO. Continuare a scongelare fino a quando la sezione del tessuto passa da una texture traslucida a una opaca o opaca.
Per l'analisi in giornata, trasferire i vetrini del microscopio montati su tessuto su ghiaccio secco in una scatola asciutta con essiccante per la conservazione. Eseguire l'applicazione della matrice MALDI e la spettrometria di massa di imaging MALDI come dimostrato in precedenza. Analizza le immagini ioniche da più repliche biologiche e confronta i risultati per una significatività tramite confronti di grafici a scatola di intensità utilizzando il software statistico SCiLS.
L'analisi MALDI in modalità ioni negativi di campioni di coltura batterica consente di rilevare decine di metaboliti. Misurazioni accurate della massa ad alta risoluzione consentono l'identificazione provvisoria di ornitina e arginina. Vengono mostrate le regioni di misura per l'analisi della spettrometria di massa per immagini.
La spettrometria di massa di questi campioni consente la mappatura spaziale dei metaboliti dell'ornitina e dell'arginina amminoacidica che risultano alterati e differenzialmente localizzati in presenza di Enterococcus faecalis. La morfologia tissutale della ceca di topo infetto è stata visualizzata utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina. Vengono mostrate immagini ottiche dei tessuti ceca del topo dopo l'applicazione di uno strato di matrice MALDI 1, 5-Diaminonaftalene.
Le immagini ioniche MALDI per l'ornitina e l'arginina mostrano distribuzioni spaziali uniche tra i campioni di tessuto. La considerazione più importante per questo protocollo è quella di mantenere l'essiccazione delicata e la manipolazione dei campioni di coltura batterica per ridurre al minimo gorgogliamento, fessurazioni e altre deformazioni del campione. Dopo la spettrometria di massa per immagini, è possibile eseguire analisi al microscopio a campo chiaro e a fluorescenza di campioni di tessuto per valutare la morfologia del tessuto.
Ciò può anche consentire la convalida mirata dei percorsi molecolari utilizzando metodi di imaging basati su anticorpi.
