Un metodo di laboratorio obiettivo presentato qui può aiutare a studiare la reazione di ipersensibilità da contatto nei topi, che imita la dermatite allergica da contatto negli esseri umani. La reazione di ipersensibilità da contatto può essere misurata non solo dall'edema dell'orecchio, ma anche da vari test di laboratorio che consentono lo studio dei meccanismi cellulari coinvolti in questa reazione. Il modello di ipersensibilità più a contatto può testare vari fattori ambientali e nuove sostanze per dimostrare se i fattori testati modulano le risposte immunitarie dipendenti dalle cellule T, che possono essere utilizzate per implementare nuove terapie.
Inizia radendo la pelle del topo con una lametta da barba ed etichettando la zampa. Sei ore prima dell'induzione dell'ipersensibilità da contatto, o CHS, applicare sapone grigio con acqua e radere un'area quadrata di due centimetri sul petto e sull'addome del topo. Lo stesso giorno, sensibilizzare i topi applicando 150 microlitri di 5% di aptene appena preparato sul punto precedentemente rasato.
Nel mouse di controllo, applicare solo il veicolo. Asciugare il punto di apten per 30 secondi prima di rimettere l'animale nella gabbia. Il quarto giorno, misurare lo spessore dell'orecchio di un topo anestetizzato usando un micrometro all'ora zero da un osservatore ignaro dei gruppi sperimentali.
Quindi, applicare 10 microlitri di 04% apten appena preparato su entrambi i lati delle orecchie nei gruppi di test e controllo e lasciare asciugare per 30 secondi. Il quinto giorno, 24 ore dopo la precedente applicazione dello 0,4%, ripetere la misurazione dello spessore dell'orecchio per la misurazione delle 24 ore. 24 ore dopo la misurazione dello spessore dell'orecchio, quando il topo è ancora in anestesia profonda, tagliare le orecchie il più vicino possibile al cranio usando le forbici.
Sul lato distale delle orecchie, fai un pugno di sei millimetri di diametro usando un pugno bioptico. Misurare il peso di ciascuna biopsia dell'orecchio sulla bilancia analitica ed esprimerlo in milligrammi. Per il test della mieloperossidasi o MPO, mettere le biopsie dell'orecchio in un tubo di microcentrifuga da due millilitri con perline di acciaio inossidabile e aggiungere 500 microlitri del tampone preparato.
Omogeneizzare le biopsie per 10 minuti in un omogeneizzatore e quindi raffreddare il campione per 15 minuti a 4 gradi Celsius prima di omogeneizzarlo nuovamente per 10 minuti. Estrarre le perline una volta che le biopsie sono omogeneizzate. Congelare gli omogenati a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti.
Scongelare e vortice i campioni e ripetere la procedura di omogeneizzazione e congelamento tre volte. Una volta fatto, centrifugare l'omogenato a 3.000 G per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Raccogliere il surnatante con una pipetta per misurare l'attività MPO ed esprimerlo in unità per un milligrammo di proteina.
Per eseguire un test di permeabilità vascolare, sensibilizzare i topi il giorno zero e il quarto giorno, sfidare direttamente applicando apten sulle orecchie utilizzando la procedura precedentemente menzionata. 23 ore dopo, iniettare per via endovenosa 8,3 microlitri per grammo di peso corporeo del colorante blu Evans all'1% nella soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco, o DPBS, al topo anestetizzato. Dopo un'ora, anestetizzare nuovamente il topo per raccogliere le biopsie dell'orecchio, come descritto in precedenza.
Per estrarre il colorante dal tessuto, incubare le biopsie nelle provette contenenti un millilitro di formammide a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per 18 ore. Dopo aver raccolto le biopsie dell'orecchio, quando il topo è ancora in anestesia profonda, rimuovere il bulbo oculare con una pinzetta. Esercitare una leggera pressione sul topo e raccogliere il sangue dal seno retroorbitale nel tubo per la raccolta del siero.
Capovolgere il tubo sei volte e attendere 30 minuti affinché il sangue si coaguli. Quindi, centrifugare il tubo a 1.300-2.000 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Sensibilizzare i topi donatori con TNCB hapten il giorno zero utilizzando la procedura precedentemente menzionata Il quarto giorno, dopo aver disinfettato la pelle, isolare i linfonodi ascellari e inguinali, o ALN, dal topo anestetizzato usando una pinza, seguita dall'isolamento della milza.
Schiacciare il tessuto tra le estremità smerigliate di due vetrini da microscopio e passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare con una dimensione dei pori di 70 micrometri. Quindi, lavare le cellule con DPBS integrato con siero bovino fetale all'1% e centrifugarle a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare rimanente in uno a cinque millilitri di DPBS.
Preparare una miscela 1:1 di ALN e milza per ottenere una concentrazione fino a 7,0 volte 10 alle cellule settima in 200 microlitri di DBPS prima di iniettare per via endovenosa la miscela di cellule effettrici di CHS in un topo anestetizzato. Misurare lo spessore dell'orecchio all'ora zero e dopo 24 ore di sfida. I dati hanno mostrato che i topi sensibilizzati al TNCB e sfidati nelle orecchie quattro giorni dopo hanno sviluppato un aumento significativo del gonfiore dell'orecchio, rispetto ai topi di controllo sham-sensibilizzati e poi sfidati in modo simile.
L'aumento dell'edema dell'orecchio nel gruppo di prova ha comportato un aumento del peso dell'orecchio, dell'attività MPO, della concentrazione di interferone gamma negli estratti dell'orecchio, dei cambiamenti del derma edematoso nell'esame istologico e della permeabilità vascolare dell'orecchio Gli anticorpi IgG1 specifici per TNP erano elevati nei sieri dei topi di prova rispetto agli animali di controllo. Gli animali che hanno ricevuto le cellule effettrici di CHS da donatori precedentemente sensibilizzati con TNCB hanno mostrato un aumento significativo del gonfiore dell'orecchio, rispetto agli animali che non hanno ricevuto le cellule. Il momento più critico è quello di innescare l'ipersensibilità da contatto.
La soluzione di Hapten è molto volatile e sensibile alla luce, quindi deve essere applicata rapidamente sulla pelle degli animali. Ulteriori test possono essere eseguiti sulle cellule effettrici isolate. Ad esempio, possono essere stabilite colture cellulari per valutare la capacità di proliferare in presenza di antigeni.
