Questo modello non solo può essere utilizzato per esplorare la patogenesi dell'ACD, ma è anche applicabile per l'evoluzione preclinica di nuovi metodi terapeutici, che ha un significato importante. Questo è un modello animale stabile ed efficiente con molti vantaggi, come un breve periodo sperimentale, un funzionamento facile, sintomi evidenti e un alto tasso di successo. Il nostro protocollo sperimentale è molto dettagliato e facile da usare.
Assicurarsi di seguire correttamente ogni passaggio del protocollo. Prima di iniziare la modellazione, acclimatare i topi all'ambiente per una settimana con libero accesso a cibo e acqua. Il giorno della modellazione, utilizzando una lampada a raggi ultravioletti e il 75% di alcol, pulire e disinfettare l'ambiente e i controsoffitti.
Applicare acqua saponata sull'addome dei topi usando un batuffolo di cotone e radere l'area nella direzione della crescita dei peli con una lama o un rasoio. Pesare il mouse e confrontare le variazioni di peso tra ciascun gruppo. Prima di eseguire la stimolazione della sensibilizzazione addominale, assicurarsi il pieno recupero di eventuali lesioni minori alla pelle dell'addome del topo indotte dalla rasatura.
Preparare la soluzione di DNFB allo 0,5% e diluirla con una miscela di acetone e olio d'oliva in un rapporto di 4 a 1. Utilizzando una pistola per pipette, soffiare e mescolare 20 volte per miscelare accuratamente la soluzione DNFB. Applicare 25 microlitri della soluzione di DNFB allo 0,5% al centro dell'area di rasatura addominale con un pipetter e distribuire leggermente con il lato liscio della punta del pipetter per disperderlo uniformemente.
Dopo 30 secondi di stimolazione DNFB, posizionare il topo in una gabbia vuota senza lettiera per evitare che il topo strofini via la soluzione di DNFB. Quando la soluzione è completamente asciutta, riportare il topo nella sua gabbia originale con libero accesso al cibo e all'acqua. Per la stimolazione della sensibilizzazione dell'orecchio, orientare il corpo del topo e posizionare il bordo esterno del padiglione auricolare rivolto verso il basso per evitare che la soluzione entri nel condotto uditivo durante la stimolazione DNFB.
Nei giorni 4 e 10, utilizzando un pipetter, applicare 20 microlitri del veicolo, o soluzione di DNFB allo 0,2% lentamente e uniformemente sulla superficie interna del padiglione auricolare sinistro, e distribuire delicatamente la soluzione utilizzando il lato liscio del pipetter. Lasciare l'orecchio destro non trattato. Attendere che la soluzione DNFB sia asciutta e riposizionare il mouse nella gabbia.
Dopo la stimolazione della sensibilizzazione addominale e dell'orecchio, pesare i topi ogni due giorni a partire dal primo giorno. Confronta il peso di ciascun topo con il giorno zero e valuta l'effetto dell'ACD sul peso corporeo dei topi al variare del peso. Cattura foto ad alta risoluzione delle orecchie del topo per registrare i sintomi clinici dell'ACD ogni due giorni, a partire dal primo giorno.
Utilizzando calibri vernier, misurare lo spessore del padiglione auricolare alla stessa ora ogni giorno per risultati accurati. Impedire alle pinze vernier di continuare il serraggio verso l'interno quando c'è un leggero blocco per prevenire danni ai tessuti all'orecchio del topo. Mantieni la posizione fissa e registra i dati per entrambe le orecchie.
Registrare la media dei tre dati e valutare il gonfiore dell'orecchio in micrometri. Per valutare il grado di gonfiore infiammatorio il giorno 11, preparare la soluzione di colorante blu Evans allo 0,5% e diluirla con PBS. Per immobilizzare il mouse con un fissatore, aprire il coperchio, tenere la coda del mouse, fare in modo che la testa del topo sia rivolta verso il fissatore e consentire al topo di salire istintivamente nel fissatore.
Coprire il coperchio. Fai uscire la coda del mouse dal foro sul coperchio e regola la lunghezza del fissatore per esporre l'intera coda del mouse. Pulire ripetutamente la coda con un batuffolo di cotone alcolico o immergerla in acqua tiepida per 30 secondi, pizzicare delicatamente la radice della coda per riempirla ed espandere le vene su entrambi i lati.
Iniettare lentamente la soluzione di Evans Blue Dye nella vena della coda del topo usando un ago da insulina da 1 mm sotto l'irradiazione di una fonte di luce fredda. Attendere 15 minuti per scattare foto delle orecchie del mouse. Le orecchie di topo del gruppo DNFB hanno mostrato evidenti sintomi clinici paragonabili all'ACD, con aree sensibili che mostrano i sintomi tipici di arrossamento, secchezza, erosione ed essudazione.
Tuttavia, la somministrazione all'orecchio di acqua pura o il controllo del solvente non ha prodotto alcun sintomo simile al gruppo DNFB. Nel gruppo DNFB, rispetto all'orecchio destro non trattato, Lo spessore dell'orecchio sinistro è aumentato significativamente dopo la stimolazione DNFB. Non vi era alcuna differenza significativa nei gruppi di controllo e veicolo.
L'orecchio sinistro dei topi del gruppo DNFB è diventato blu scuro dopo l'iniezione del colorante blu Evans, che era visivamente diverso dall'orecchio destro. Le orecchie sinistra e destra dei topi nei gruppi di controllo e dei veicoli erano approssimativamente dello stesso colore. L'aumento di peso del topo è stato leggermente rallentato dal DNFB, o semplice stimolazione del veicolo, ma non ha comportato una significativa perdita di peso.
La stimolazione ripetuta di DNFB nell'orecchio del topo ha provocato l'allargamento della milza e un aumento dell'indice della milza. Al contrario, l'indice di milza dei topi nel gruppo di veicoli non è cambiato in modo significativo. Assicurarsi che la soluzione DINFB sia completamente miscelata e applicata uniformemente all'orecchio del topo senza fluire nel condotto uditivo.
Questa è la chiave del successo della modellazione.
