Lo studio in vitro e della cinetica dell'aptamero fluorogenico cellulare consente all'utente di valutare se le interazioni del colorante aptamero sono abbastanza veloci da studiare un processo di interesse in tempo reale. Le tecniche presentate consentono misure cinetiche quantitative sia all'interno che all'esterno della cellula, ognuna delle quali potrebbe essere rilevante a seconda dell'applicazione dell'aptamero. I metodi presentati possono essere applicati a qualsiasi sistema di RNA fluorogenico, inclusi aptameri alternativi e biosensori basati su RNA per piccole molecole.
Per iniziare, impostare il programma di rinaturazione dell'RNA dal termociclatore. Creare il programma selezionando crea nuovo programma"aggiungi nuova fase"e aggiungi nuovo passaggio"più volte per aggiungere passaggi specifici della temperatura prima di premere salva"Regola le impostazioni aggiuntive in base al programma. Per rinaturare gli RNA di spinaci due e broccoli, preparare due gambi micromolari di ciascun RNA in acqua doppia distillata in un tubo PCR a parete sottile da 0,5 millilitri.
Quindi aggiungere volumi uguali di tampone di rinaturazione a due x per creare una soluzione di RNA micromolare. Inserire i tubi nel termociclatore. Aprire il programma di rinaturazione salvato e premere Esegui"Quindi, impostare il programma iniettore lettore di piastre.
Sul lettore di piastre a fluorescenza, selezionare la temperatura "e impostarla su 37 gradi Celsius. Prima di iniziare la cinetica, assicurarsi che la temperatura sia equilibrata a questo valore. Aprire il software del lettore di piastre.
Selezionare impostazioni"quindi vista acquisizione" per inserire il programma per le misure cinetiche, selezionare loop" per ciascun pozzetto. Quindi, impostare l'impostazione di base su 60 letture di base e le impostazioni di iniezione intelligente per l'iniezione da 10 microlitri. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione della fluorescenza su 448 nanometri, la lunghezza d'onda di emissione su 506 nanometri e la cartuccia su mono.
Impostare il tempo di lettura totale su 10 minuti con intervallo di lettura di 0,5 secondi. Impostare PMT e ottica su sei flash per lettura. Quindi ciclo di input al pozzo successivo.
Per preparare l'iniettore lettore di piastre, selezionare iniettare sul lettore di piastre e fornire una piastra di raccolta dei rifiuti quando indicato. Quindi selezionare "wash" e pulire il tubo di iniezione seguendo le istruzioni sul lettore di piastre con volumi di un millilitro di acqua doppia distillata, etanolo al 75% e quindi acqua distillata. Quindi selezionare aspirare"consentendo all'iniettore di espellere il liquido in eccesso.
Quindi selezionare prime"per innescare l'iniettore con due 260 microlitri di 100 micromolari D F H B I.To eseguire un esperimento di cinetica aggiungere 80 microlitri di miscela master tampone legante a un pozzetto di una piastra inferiore trasparente da 96 pozzetti. Quindi aggiungere 10 microlitri di RNA rinaturato. Lasciare che la piastra e la soluzione D F H B I nell'iniettore si equilibrino a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Quindi, selezionare il pozzo da analizzare nelle impostazioni del software sotto l'area di lettura. Quindi, nella scheda Home, selezionare "esegui" per eseguire il programma cinetico descritto in precedenza. Ripetere questo processo fino al completamento di tutti gli esperimenti.
Dopo l'esecuzione, lavare l'iniettore per rimuovere la soluzione rimanente di D F H B I dal tubo di iniezione, come dimostrato in precedenza. Per impostare i file sperimentali accendere il citometro a flusso e il computer. Crea un nuovo file nella scheda Esplora esperimenti facendo clic con il pulsante destro del mouse sul citometro a flusso"nome utente.
Quindi selezionare nuovo esperimento"nella finestra a discesa e quando viene visualizzata una nuova finestra sullo schermo del computer, selezionare il tipo di esperimento come tubi"e quindi selezionare ok"Nel nuovo file dell'esperimento fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella del gruppo e selezionare aggiungi nuova provetta di esempio"Etichetta le provette per ogni punto temporale specifico e replicare facendo clic con il pulsante destro del mouse sul campione" e selezionando rinomina" nel menu a discesa. Quindi, preparare una soluzione cellulare diluita aggiungendo 1,5 millilitri di un X P B S e tre microlitri di cellule indotte in mezzi AI in una provetta di coltura. Prima di aggiungere il colorante, misurare la fluorescenza di fondo delle cellule per osservare la piega accendersi nel tempo.
Una volta aggiunto il colorante, posizionare la provetta di coltura contenente cellule in P B S nel sollevatore della provetta del campione e sollevare il sollevatore sull'ago per iniezione del campione. Quindi selezionare il file campione appropriato all'interno della scheda del pannello di raccolta e fare clic su registra "Una volta completata la corsa, abbassare il sollevatore del tubo di campionamento con il tubo di coltura a mano. Per avviare una fase di risciacquo, per lavare il sistema fluidico e ridurre al minimo il trascinamento tra ciascun campione biologico replicato.
Per passare all'esempio seguente, selezionare il file di esempio successivo facendo clic sull'icona della freccia destra accanto al nome del tubo di campionamento sotto l'icona del record. Per misurare la fluorescenza delle cellule con colorante aggiungere 1,4 microlitri di colorante concentrato in un X P B S con cellule, per ottenere una concentrazione finale di 50 micromolari D F H B I uno T.Chiudere il coperchio del tubo di coltura e capovolgere da tre a cinque volte per miscelare uniformemente la soluzione. Quindi, rimuovere il coperchio e posizionare il tubo di coltura nel sollevatore del tubo del campione.
Dopo aver sollevato il supporto verso l'ago per iniezione del campione, fare clic sull'icona "record" sotto il file di campione appropriato. Quindi, iniziare un timer premendo start"In vitro cinetica degli aptameri fluorogenici spinaci due e broccoli, ha mostrato una cinetica di associazione bifase per il legame al colorante D F H B I. Per entrambi gli aptameri, i dati cinetici sono stati meglio adattati dall'associazione a due fasi rispetto a una fase a lunghi tempi di misurazione.
La curva di adattamento migliore ha determinato le costanti di velocità e i valori di emivita per le associazioni fast e slow. Gli spinaci due nello stato di competenza vincolante, hanno mostrato un'accensione più rapida rispetto ai broccoli. La cinetica della seconda fase per entrambi gli aptameri è simile e può corrispondere a una fase comune di limitazione della velocità.
Le curve cinetiche degli aptameri sono composte da un grado simile di RNA ad associazione rapida. Per le cellule che esprimono spinaci due T RNA, l'intensità media di fluorescenza o M F I aumenta immediatamente al punto di tempo zero. Inoltre, la fluorescenza cellulare ha raggiunto il suo massimo valore equilibrato di M F I entro cinque minuti.
Al contrario, le cellule di controllo hanno mostrato una bassa fluorescenza di fondo e nessun cambiamento nei valori di M F I con l'aggiunta di D M S O I metodi presentati consentono ai ricercatori di determinare come possono rendere più veloci i sensori basati sull'RNA negli aptameri fluorogenici.
