Per ottenere una migliore comprensione della composizione e della struttura del plesso coroideo, un metodo efficace per isolare il plesso coroideo dai ventricoli cerebrali è un primo passo inestimabile. Con questa tecnica di microdissezione è possibile sezionare il plesso coroideo dai ventricoli cerebrali pur contenendone la funzione, la vitalità e la struttura senza contaminare il plesso coroideo con il tessuto circostante. Un ostacolo significativo nell'isolamento del plesso coroideo è identificare la struttura mentre galleggia ancora nei ventricoli cerebrali.
Colorare il plesso coroideo con blu di bromofenolo facilita l'isolamento. A dimostrare la procedura sarà Elien Van Wonterghem, il nostro responsabile di laboratorio. Inizia con la preparazione di un anestetico terminale, una soluzione di perfusione transcardica e una soluzione necessaria per la microscopia elettronica a scansione, o SEM, e altre soluzioni come menzionato nel testo.
Per isolare il cervello del topo, posizionare l'animale anestetizzato terminale nella posizione del decubito dorsale e fissare il topo bloccando gli arti su un piatto. Disinfettare il torace spruzzando il 70% di etanolo prima di praticare un'incisione di circa quattro centimetri appena sotto il diaframma utilizzando una lama chirurgica in acciaio al carbonio. Aprire la pelle ed esporre il torace usando le forbici chirurgiche.
Tagliare completamente il diaframma e separare il torace per esporre i polmoni e il cuore pulsante. Utilizzando una pompa di perfusione transcardiare il mouse con 10 millilitri della soluzione di perfusione ad una velocità di 4,5 millilitri al minuto. Inserire un ago di calibro 26 nel ventricolo sinistro per pompare la soluzione nel circuito sistemico.
Usando le forbici chirurgiche, tagliare l'atrio destro affinché il sangue esca dalla circolazione. Dopo la decapitazione del topo tagliare aprire il cuoio capelluto facendo un'incisione iniziando tra le orecchie verso la superiore agli occhi. Tirare la pelle lateralmente per esporre il cranio.
Quindi tagliare il cranio seguendo le suture squamose verso la parte nasale. Una volta fatto, posizionare il cervello in una capsula di Petri ghiacciata e aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato al tessuto cerebrale. Per isolare il plesso coroideo che galleggia nel quarto ventricolo tagliare delicatamente il cervelletto dal cervello usando un bisturi.
Rimuovere le restanti parti del tessuto del tronco cerebrale dal cervelletto. Ruotare il cervello in modo che la linea di taglio sia rivolta verso l'alto, assicurandosi che la quarta cavità ventricolare sia visibile nel mezzo della sezione con il plesso coroideo che giace nel sito dorsale. Se necessario, aprire il ventricolo tirando il tessuto connettivo con una pinza affilata.
Strappare delicatamente il plesso coroideo dalla parete del ventricolo usando una piccola pinza affilata. Per isolare il plesso coroideo dal ventricolo laterale, tagliare sagittalmente il cervello in due emisferi usando una piccola pinza affilata. Ruota un emisfero cerebrale in modo che la linea di taglio sia verso l'alto.
Per rivelare il ventricolo laterale allontanare delicatamente la corteccia dal talamo. Ritrarre l'ippocampo sulla linea di taglio medio-sagittale. Il ventricolo laterale è ora visibile con il plesso coroideo che giace nella parte inferiore del ventricolo.
Se necessario, aprire un po 'il ventricolo aprendo il tessuto connettivo con una pinza affilata. Utilizzare piccole pinze affilate per strappare delicatamente il plesso coroideo dalla parete del ventricolo. Per eseguire la preparazione del campione per SEM, trasferire il plesso coroideo appena isolato in una soluzione di fissazione appena fatta e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.
Una volta fatto, lavare il campione tre volte utilizzando da tre a cinque millilitri di tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare per cinque minuti ciascuno. Postfissare i campioni in tre-cinque millilitri di tetrossido di osmio al 2% in tampone di cacodilato di sodio da 0,1 molari per 30 minuti. Quindi lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno utilizzando da tre a cinque millilitri di acqua ultrapura.
Successivamente, disidratare i campioni in una serie crescente di concentrazioni di alcol etilico ghiacciato con 15 minuti per soluzione di alcol etilico. Utilizzare un essiccatore di punti critici per asciugare correttamente il campione. Posizionare il campione con attenzione su un supporto per campioni con un adesivo carbone e visualizzare i campioni del plesso coroideo utilizzando SEM.
Il presente protocollo ha facilitato l'isolamento efficiente del plesso coroideo dal cervello del topo lateralmente e dal quarto ventricolo. La perfusione con blu di bromofenolo ha portato alla visualizzazione del plesso coroideo. Quando il blu di bromofenolo non è stato consentito nelle ulteriori fasi di lavorazione, la perfusione con PBS-eparina o nessuna perfusione è stata eseguita per l'elaborazione.
L'analisi morfologica SEM della superficie delle cellule epiteliali del plesso coroideo, o CPE, mostra chiaramente la struttura a due bracci del quarto ventricolo e la tipica forma a forma di C del plesso coroideo laterale isolato dal ventricolo laterale. Un maggiore ingrandimento del SEM ha rivelato strutture simili a vescicole sul lato apicale delle cellule CPE e dei microvilli, indicando che le alterazioni morfologiche delle cellule CPE in condizioni di malattia possono essere studiate utilizzando SEM. È importante toccare ed estrarre solo il tessuto del plesso coroideo per non contaminare il campione con il tessuto circostante.
Utilizzare la necessaria cautela per preservare la struttura del plesso coroideo. Una varietà di tecniche a valle possono essere applicate sul plesso coroideo isolato per studiarne la struttura e la funzione, passando dall'analisi al microscopio all'analisi del trascrittoma alla citometria a flusso. La microdissezione del plesso coroideo dal cervello ci consente di ottenere una migliore comprensione della struttura e della funzione di questo piccolo tessuto cerebrale.
Questa conoscenza è essenziale per comprendere meglio il suo ruolo nelle malattie neurologiche.
