Questo è un metodo idroponico non invasivo per misurare l'architettura del sistema radicale utilizzando apparecchiature di laboratorio di routine. Questo protocollo consente la visualizzazione completa dell'intero apparato radicale della pianta diffondendolo manualmente. Uno dei principali vantaggi dell'analisi RSA è che consente di studiare il sistema radicale delle piante senza la necessità di introdurre contaminazioni elementari indesiderate.
Questo metodo può registrare l'interazione ambientale diretta, comprese le condizioni ormonali, nutritive e climatiche, con l'RSA dei sistemi vegetali. Iniziare la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis immergendo un piccolo misurino di circa 100 semi in acqua distillata a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, centrifugare brevemente i semi a 500 g per cinque secondi utilizzando una centrifuga da tavolo.
Quindi, decantare l'acqua e aggiungere 700 microlitri di etanolo al 70% prima di vorticare il tubo per alcuni secondi. Centrifugare nuovamente i semi. Se necessario, ripetere il vortice e la centrifugazione, assicurando che il trattamento con etanolo al 70% non superi i tre minuti.
Dopo tre minuti, sciacquare immediatamente i semi con acqua sterile. Quindi, trattare i semi con candeggina commerciale diluita contenente una goccia di TWEEN 20 per sette minuti. Mescolare i semi con una soluzione di candeggina invertendo rapidamente i tubi da otto a 12 volte.
Dopo una breve centrifugazione, decantare il surnatante con una pipetta da un millilitro e sciacquare i semi almeno cinque volte con acqua sterile, seguendo la stessa procedura di vortice. Lasciare i semi sterilizzati superficiali in acqua e incubarli per due o tre giorni a quattro gradi Celsius per la stratificazione. Autoclavare la scatola standard magenta riempita per metà con acqua distillata.
Tagliare il foglio di policarbonato autoclavato in rettangoli di quattro per otto centimetri con un punto medio dentellato più di metà del rettangolo in modo che due rettangoli possano incastrarsi insieme per formare una forma a X. Utilizzare questa configurazione per tenere la rete in polipropilene di dimensioni dei pori di 250 micrometri tagliata in quadrati di sei per sei centimetri. Nell'armadio del flusso d'aria laminare, aggiungere mezzo mezzo MS basale sterile con vitamine più 1,5% di saccarosio a ciascuna scatola per raggiungere il bordo inferiore della rete in polipropilene.
Semina idroponicamente i semi sterilizzati sulla rete e coltivali per tre giorni. Dopo tre giorni, trasferire le piantine su una maglia di 500 micrometri delle dimensioni dei pori e lasciarle crescere per due giorni. Quindi, trasferire le piantine sui mezzi di controllo e sui terreni sperimentali e lasciare crescere i semi per sette giorni.
Aggiungere da 10 a 20 millilitri di acqua di rubinetto filtrata in autoclave alla piastra di Petri. Estrarre delicatamente le piantine dalla maglia di 500 micrometri. Con l'aiuto di un pennello artistico rotondo, spargi radici simili a piante nel piatto pieno d'acqua e immergili nell'acqua.
Inclinare leggermente la piastra per rimuovere l'acqua. Scansiona o fotografa queste lastre di Petri in modo appropriato. Misurare l'architettura del sistema di root, o tratti RSA, utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente, quindi aprire il file da analizzare.
Dopo aver impostato la scala, usate lo strumento linea retta per creare una selezione di linea che delinei la barra della scala. Completa la struttura facendo clic con il pulsante destro del mouse, facendo doppio clic o facendo clic nella casella all'inizio. Per misurare la lunghezza della barra di scala nota in pixel, fare clic su Analizza, seguito da Misura sulla barra degli strumenti.
Prendi nota della lunghezza in pixel. Aprire la finestra di dialogo Imposta scala facendo clic sulla scheda Imposta scala nella scheda Analizza. Controlla la lunghezza dei pixel in lontananza nel campo pixel.
Quindi, immettere il valore della barra della scala nel campo Distanza nota e impostare l'unità di lunghezza in millimetri. Blocca la scala per questa particolare immagine facendo clic su OK. Usate lo strumento linea segmentata per una selezione di linee che delinea la lunghezza della radice.
Dopo aver completato la struttura, regolate la selezione della linea facendo clic e trascinando le maniglie bianche e nere lungo il contorno. Nella scheda Analizza di ImageJ, selezionare il comando di misura e quantificare la lunghezza della radice. Trasferisci i dati misurati su un foglio di calcolo facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra dei risultati, selezionando Copia tutto dal menu a comparsa, passando al foglio di calcolo e incollando i dati.
Per la misurazione e il calcolo dei tratti RSA, misurare la lunghezza della radice primaria tra la giunzione ipocotilicica e l'estremità delle punte delle radici. Quindi misurare le radici laterali del primo ordine, o una lunghezza LR di un grado, e le radici laterali del secondo ordine, o una lunghezza di due gradi LR. Una volta fatto, copia e incolla tutte le misurazioni nel foglio di calcolo.
Misurare e registrare la zona di ramificazione della radice primaria, o BZPR, che si estende dal primo punto emergente della radice laterale all'ultimo punto emergente della radice laterale. Allo stesso modo, registrare il numero di radici laterali originate all'interno del confine del BZPR. Quindi, misurare la lunghezza media delle radici laterali di primo e ordine superiore.
Ricavare la lunghezza media delle radici laterali primarie dividendo la lunghezza totale delle radici laterali primarie per il numero totale di radici laterali primarie. Quindi, per misurare la lunghezza media delle radici laterali del secondo ordine, calcolare la lunghezza media delle radici laterali secondarie dividendo la lunghezza totale delle radici laterali secondarie per il numero totale di radici laterali secondarie. Misurare la densità della radice laterale primaria dividendo il numero di radici laterali primarie per la lunghezza del BZPR.
Quindi, misurare la zona di ramificazione delle singole radici laterali e calcolare la densità della radice laterale secondaria dividendo il numero di radici laterali secondarie per la lunghezza delle zone di ramificazione delle lunghezze delle radici laterali di secondo ordine. Una volta fatto, misurare la lunghezza totale della radice, o TRL. Questo è l'aggregato delle radici primarie e delle lunghezze delle radici laterali primarie e secondarie.
Il sistema idroponico utilizzato in questo esperimento ha funzionato bene, riflettendo l'apparente fenotipo contrastante in condizioni carenti di fosfato inorganico e sufficienti. Vari tratti RSA sono stati analizzati in regimi di fosfato inorganico contrastanti in condizioni idroponiche. Il trattamento carente di fosfato inorganico ha invocato un fenotipo radicale che mostra un RSA più corto, meno profondo e meno ramificato, rispetto alla condizione sufficiente di fosfato inorganico.
La lunghezza della radice primaria è stata significativamente attenuata nella condizione carente di fosfato inorganico. Un guadagno significativo e rapido nella lunghezza della radice primaria in presenza di fosfato inorganico millimolare o mezzi di controllo indicava l'efficienza del sistema idroponico e rifletteva adeguatamente i cambiamenti fisiomorfologici. La zona di ramificazione è stata significativamente ridotta nella condizione carente di fosfato inorganico.
La lunghezza media della radice laterale primaria è stata significativamente ridotta nella condizione di deficit di pi greco. La lunghezza media della radice laterale secondaria è stata ridotta in modo simile a causa della condizione carente di fosfato, tuttavia, era inferiore in quantità rispetto alla lunghezza media della radice laterale primaria. Il numero di radici laterali primarie e secondarie è diminuito pesantemente nella condizione carente di fosfato, rispetto alla condizione di fosfato inorganico di controllo, 1,25 millimolari.
La densità primaria della radice laterale non è stata modificata nella condizione di carenza di fosfato, rispetto alla condizione di fosfato inorganico di controllo, 1,25 millimolari. La densità della radice laterale secondaria non ha mostrato alcun cambiamento significativo, indicando l'importanza della densità della radice laterale per ottenere informazioni sulla plasticità RSA. Ho rimosso delicatamente le piantine dalla rete usando una pinzetta.
Spargo le radici in un piatto pieno d'acqua usando un pennello rotondo, tutte le radici primarie, e lo stendo dritto, stendo simmetricamente le radici laterali, stendo le radici laterali del secondo ordine collegate alle radici laterali del primo ordine. Un metodo simile può essere utilizzato per calcolare l'area di fuliggine delle punte delle piante di Arabidopsis. Le foglie di Arabidopsis possono essere distribuite sull'altra piastra seguite dall'acquisizione e dall'analisi delle immagini utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente per determinare l'area di fuliggine.
Questo protocollo può essere utilizzato per rispondere a qualsiasi domanda sull'influenza dell'ambiente sulla plasticità del sistema di root.
