Questo articolo descrive principalmente un metodo economico per preparare campioni di piante e imaging utilizzando DESI-MSI e può superare gli svantaggi associati ai tessuti asciutti, che si fratturano facilmente quando l'azoto soffia. La radice è stata criosezionata sul microtomo criostato, mentre la foglia è stata preparata mediante imprinting, che richiede una macchina costosa o perde intensità del segnale. Il nostro metodo può superare questi limiti.
Questo metodo può essere utilizzato nella metabolomica spaziale delle piante come la distribuzione e il movimento di sostanze tossiche nelle piante sotto stress abiotico e biotico. Per iniziare, prendi radici e foglie pulite da una pianta di salvia miltiorrhiza di due anni e taglia direttamente con uno spessore della sezione trasversale di circa tre-cinque millimetri. Quindi, incollare il campione su un vetrino da microscopio ad adesione utilizzando nastro biadesivo.
Posizionare un altro vetrino da microscopio sopra il campione e avvolgerli con una pellicola sigillante come un sandwich. Quindi, congelare il campione sandwich a meno 80 gradi Celsius per almeno quattro ore, quindi sottoporlo a un vuoto d'aria per due ore con la temperatura intrappolata a meno 75 a meno 82 gradi Celsius e il vacuometro a 2,5-3,7 pascal. Per l'analisi, dopo aver rimosso i campioni dalla cella frigorifera, portarli a temperatura ambiente in un essiccatore per evitare la condensa sulla superficie del campione prima di sottoporre il campione all'applicazione della matrice.
Implementare la configurazione del rilevatore di strumenti e la calibrazione di massa in ionizzazione elettrospray o modalità ESI. Eseguire la configurazione del rilevatore utilizzando leucina e cefalina in acetonitrile in acqua con un rapporto di uno a uno ed eseguire la calibrazione di massa con formiato di sodio e isopropanolo di acqua in un rapporto di uno a uno. Estrarre la sorgente ESI e montare l'unità DESI sullo spettrometro di massa.
Collegare l'alimentazione di azoto gassoso all'unità DESI e regolare la pressione del gas a circa 0,5 megapascal. Riempire una siringa da cinque millilitri con leucina e cefalina e acido formico in acqua metanolo in un rapporto da uno a nove e collegare la siringa alla pompa a siringa ad alte prestazioni per fornire solvente per la ionizzazione delle sostanze chimiche nel campione. Quindi, collegare un capillare che fornisce solvente alla siringa e allo spruzzatore DESI.
Il solvente che fornisce il capillare è un capillare standard di dimensioni con un diametro interno di 75 micrometri e un diametro esterno di 375 micrometri. Avviare la pompa a siringa e impostare la velocità di infusione a due microlitri al minuto per ottenere un flusso costante e spruzzare il solvente. Spegnere la valvola del gas azoto e accenderla dopo circa 15 secondi.
Una piccola goccia di solvente soffia sul palco e lo spruzzo può essere visto se il flusso di solvente è in uno stato costante. Quindi, regolare la posizione dello spruzzatore in termini di angolo di spruzzatura, asse XYZ, sporgenza e altezza. Utilizzare marcatori rossi e neri come riferimenti per ottimizzare il segnale di spettrometria di massa per ottenere un'intensità del segnale di circa una volta da 10 alla quinta in modalità sensibilità.
Poiché la sporgenza dello spruzzatore è il fattore più significativo che influenza l'intensità del segnale, regolare la protrusione cambiando la protezione del gas di azoto utilizzando una chiave da cinque millimetri. La direzione dello spruzzo influenza la qualità dell'immagine di massa. Quindi, ruotare lo spruzzatore fino a quando lo spray è dritto.
Dopo tutti questi passaggi, la configurazione è pronta per gli esperimenti ed è normalmente stabile per circa tre settimane di usabilità dopo la configurazione iniziale. Per l'imaging DESI-MS, non è richiesto alcun pretrattamento del campione. Tuttavia, rimuovere il supporto in eccesso sulle diapositive, se possibile.
Acquisire un'immagine dell'esempio sulla diapositiva. Senza toccare la superficie del campione per evitare impurità, posizionare la diapositiva sulla posizione della piastra sul palco DESI, che ha due posizioni della piastra, A e B.Utilizzare vetrini standard o una diapositiva completa per adattarsi alla posizione. Una diapositiva completa può ospitare fino a quattro diapositive e quindi ha un'area molto più ampia per gli esperimenti.
Apri il software di elaborazione delle immagini di massa ad alta definizione. Impostate una nuova piastra nella scheda Acquisisci (Acquisisci), quindi selezionate la posizione corretta della piastra, A o B, e il tipo di piastra. Nella pagina Selezione immagine selezionare i quattro angoli della diapositiva e quindi l'immagine viene regolata automaticamente sull'orientamento corretto.
Per impostare i parametri MS, selezionare il tipo di esperimento come modalità DESI-MS comunemente utilizzata in cui verrà rilevato solo lo ione padre. Quindi, selezionare la polarità come positiva o negativa poiché lo strumento può utilizzare solo una polarità in un esperimento. Quindi applicare la modalità di sensibilità per ottenere maggiori informazioni sulle sostanze chimiche in piccole quantità.
Quindi, disegna un rettangolo per definire l'area di scansione nella scheda Modello e imposta la dimensione dei pixel mantenendo uguali le dimensioni X e Y del pixel. Impostare la velocità di scansione su non più di cinque volte la dimensione dei pixel. Salvare il progetto ed esportare un foglio di lavoro per il software di acquisizione MS.
Quindi, importare il foglio di lavoro nel software di acquisizione MS e salvarlo come nuovo elenco di esempio. Premere Avvia esecuzione per iniziare la scansione delle immagini MS e aggiungere più immagini alla coda degli esperimenti importando più fogli di lavoro. Caricare il file di dati del campione nel software di elaborazione delle immagini di massa e impostare i parametri per l'elaborazione delle immagini DESI.
Poiché la leucina e la cefalina sono state utilizzate per la massa di blocco interna e la massa di blocco è l'unico punto per identificare la polarità dell'esperimento, è fondamentale impostare la massa di blocco corretta. Impostare 556.2772 per la modalità positiva e 554.2620 per la modalità negativa. Per creare un elenco di sostanze chimiche target, caricare il file di dati elaborati per visualizzare l'immagine DESI del campione.
Fare clic sul pulsante Normalizzazione per normalizzare i dati mediante cromatografia ionica totale per ottenere l'intensità relativa di una sostanza chimica specifica rispetto al riferimento, quindi è possibile confrontare diversi campioni tra loro. Disegna un'area di interesse, o ROI, e copia diverse copie sull'immagine di esempio. Quindi selezionare tutti i ROI ed esportare l'analisi multivariata per estrarre le informazioni MS da tutti i ROI.
L'imaging con spettrometria di massa delle sezioni radicali e di intere foglie mostra la distribuzione spaziale dei composti selezionati. Il colore di ogni singolo pixel rappresenta l'intensità relativa del rapporto massa/carica, e quindi può essere associato alla distribuzione naturale e all'abbondanza dello ione metabolita in tutto il campione. La distribuzione dei composti bersaglio, tanshinone IIA e acido rosmarinico, è visibile in diverse aree della radice.
Il composto tanshinol A è stato rilevato nelle sezioni fogliari Come protocollo che mira alla riproducibilità, la cosa più importante è ottimizzare l'intensità del segnale regolando la posizione dello spruzzatore in più dimensioni.
