Gli IPSC sui primati sono utili ma spesso difficili da ottenere a causa di questioni etiche e tecniche. Questo protocollo fornisce un percorso più accessibile per la generazione e il mantenimento degli IPSC dei primati. L'uso delle cellule urinarie come fonte primaria di IPSC ha un grande vantaggio in quanto possono essere ottenute in modo completamente non invasivo senza particolari tecniche.
A dimostrare la procedura sarà Jessica Radmer, una dottoranda del Wolfgang M.S.Laboratory. Per iniziare, centrifugare il tubo contenente urina a 400 G per 10 minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante, lasciando circa un millilitro nel tubo e risospendere il pellet in esso.
Lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di tampone di lavaggio delle urine contenente amfotericina e mescolare accuratamente la sospensione utilizzando una pipetta sierologica. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante, lasciando circa meno di 0,2 millilitri nel tubo. Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno urinario primario contenente amfotericina per 50 millilitri di urina inizialmente elaborata.
Rimuovere la gelatina e aggiungere un millilitro della sospensione in un pozzetto di piastra da 12 pozzetti rivestita di gelatina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per preparare una piastra di membrana a 12 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale, aggiungere 500 microlitri di matrice di membrana basale per pozzetto.
Spostare la piastra per distribuire il liquido e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, sostituire la matrice della membrana basale con 900 microlitri di terreno REMC e conservarla a 37 gradi Celsius fino all'uso. Calcola il volume dei virus Sendai necessari per una molteplicità di infezioni di cinque usando l'equazione.
Scongelare rapidamente i componenti del kit di riprogrammazione Sendai nel bagno d'acqua temperato a 37 gradi Celsius. Aggiungere il mezzo REMC per un totale di 100 microlitri a un tubo prima di aggiungere il volume calcolato dei virus Sendai e miscelare. Dopo la dissociazione delle cellule urinarie come descritto nel manoscritto, contare le cellule usando il contatore di cellule e trasferire il numero desiderato di cellule in un tubo da 1,5 millilitri.
Ottenere il pellet mediante centrifugazione e risospenderlo in 100 microlitri della miscela di virus Sendai preparata. Incubare il tubo per un'ora a 37 gradi Celsius per l'infezione da sospensione. Dopo l'incubazione, aggiungere REMC per un totale di un millilitro prima di seminare la sospensione cellulare nella membrana basale rivestita di 12 pozzetti rivestita di matrice.
Dopo la trasduzione, cambiare il terreno ogni due giorni fino allo sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte, o IPSC, colonie con il passaggio al mezzo di generazione PSC il quinto giorno. Quando le colonie IPSC crescono abbastanza grandi per il passaggio del grumo, aspirare il terreno dalle cellule coltivate e lavare accuratamente le cellule con 500 microlitri di DPBS. Dopo aver rimosso il DPBS, aggiungere 500 microlitri di EDTA 0,5 millimolare al pozzetto e incubare per due o cinque minuti.
Osservare attentamente le cellule al microscopio fino a quando le colonie iniziano a staccarsi. Quando i bordi delle colonie iniziano a staccarsi e gli spazi tra le cellule diventano visibili, rimuovere l'EDTA e aggiungere con attenzione 500 microlitri di DPBS. Aspirare il DPBS e lavare il pozzetto con 500 microlitri di terreno di coltura PSC utilizzando una pipetta P-1000.
Pipettare su e giù per disperdere le colonie in grumi di dimensioni appropriate. A seconda della confluenza, della densità desiderata delle cellule seminate e della preferenza clonale IPSC, trasferire da 1/10 a 1/50 della sospensione del grumo cellulare ai nuovi pozzetti. Spostare delicatamente la piastra avanti e indietro più volte per distribuire uniformemente i grumi nel pozzetto.
Incubare la piastra per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius per far attaccare i grumi. Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi per il passaggio. Dopo l'isolamento, si possono vedere cellule squamose e varie cellule rotonde più piccole che sono state escrete con l'urina.
Le prime cellule proliferanti aderenti possono essere viste e queste cellule crescono in grandi colonie che possono essere attraversate. Si possono osservare due tipi cellulari distinti, uno con un fenotipo epiteliale e l'altro che mostra un fenotipo più mesenchimale con forma allungata. Dopo il primo passaggio, le cellule urinarie crescono come un monostrato.
Durante la generazione di IPSC, alcune cellule aderenti possono essere viste e queste cellule iniziano a mostrare cambiamenti morfologici, indicando la riprogrammazione delle cellule. Inoltre, le cellule che formano le colonie mostrano la tipica morfologia delle cellule staminali embrionali. Tutte le IPSC generate condividono la tipica morfologia delle colonie embrionali simili alle cellule staminali, caratterizzate da cellule strettamente imballate con bordi chiaramente definiti.
L'immunocitochimica è stata utilizzata per testare l'espressione dei marcatori associati alla pluripotenza nelle IPSC dei gorilla. Inoltre, l'analisi della citometria a flusso ha mostrato che gli IPSC degli oranghi analizzati sono positivi per TRA-1-60. Inoltre, gli IPSC dei gorilla sono in grado di differenziarsi in linee di endoderma, mesoderma ed ectoderma.
Un aumento del numero di celle differenziate e una perdita di integrità e uniformità dei bordi indicano una scarsa qualità IPSC. Al contrario, i confini definiti, l'imballaggio cellulare stretto e i nucleoli prominenti significano IPSC di alta qualità. A causa della variabilità coronale, è necessario ottimizzare le condizioni specifiche del clone come il rapporto di divisione, i tempi di passaggio e le dimensioni del grumo per mantenere sani gli IPSC dei primati.
Come controlli di qualità di IPSC stabiliti, è possibile verificare la pre-potenza mediante induzione della differenziazione diretta o indiretta come la differenziazione EV in vitro, oltre a controllare l'espressione genica dei marcatori.
