La segnalazione Notch controlla la decisione e il pattern del solfato durante lo sviluppo nei metazoi. Abbiamo sviluppato un test di assorbimento degli anticorpi per marcare il ligando delta-D della tacca e visualizzare il suo traffico endocitico nei progenitori della glia radiale nel prosencefalo del pesce zebra in via di sviluppo. L'iniezione ventricolare cerebrale nascosta del pesce zebra consente l'assorbimento selettivo di Anti-Dld-Atto-647N da parte dei progenitori della glia radiale miototica che rivestono i ventricoli cerebrali in fase di sviluppo con elevata efficienza e effetti di lunga durata.
Questo protocollo può essere facilmente combinato con altre perturbazioni farmacologiche o genetiche utilizzate in diversi stadi di sviluppo e possibilmente adattate al cervello adulto e agli organoidi cerebrali 2D o 3D derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Dopo aver generato gli embrioni fecondati e averli incubati per 18-20 ore, rimuoverli dall'incubatrice. Osservali al microscopio a epifluorescenza usando prima la luce bianca con un ingrandimento di 20 volte.
Scartare gli embrioni morti che appaiono torbidi o rotti al microscopio usando una pipetta di vetro. Quindi accendere la lampada fluorescente e scegliere l'impostazione del filtro RFP del microscopio. Selezionare gli embrioni con forte fluorescenza rossa e trasferirli in un nuovo piatto con acqua d'uovo.
Ora dechorionate gli embrioni manualmente con due pinze sottili sotto luce bianca. Tenere il corion con un paio di pinze e fare una lacrima nel corion con l'altro forcipe. Aprire la lacrima con attenzione usando la pinza e renderla abbastanza grande da far passare l'embrione spingendo delicatamente l'embrione con le punte delle altre pinze.
Trasferire gli embrioni dechorionati in una nuova capsula di Petri con terreno embrionale fresco per un rapido risciacquo prima della microiniezione. Dopo aver tirato aghi per iniezione sottili su un estrattore, aprire la punta dell'ago con una pinza sotto un microscopio a dissezione stereo. Rendere il diametro della punta di circa 10 micrometri e l'angolo di conicità di circa 30 gradi.
Ora mescolare 0,5 microlitri di anticorpo anti-Dld con due microlitri dell'anticorpo anti topo L G Atto-647N pipettando da cinque a 10 volte per coniugarli e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 2,5 microlitri di tampone bloccante e 0,5 microlitri di rosso fenolo allo 0,5% alla miscela di anticorpi e miscelare mediante pipettaggio per bloccare eventuali anticorpi non coniugati rimasti nella miscela. Quindi, preparare l'1% di agarosio a basso punto di fusione nel mezzo embrionale.
Riscaldare la miscela contenuta in agarosio a 70 gradi Celsius fino a quando la miscela diventa trasparente. Dopo aver aliquotato la soluzione di agarosio, tenerli in un blocco di calore a 40 gradi Celsius. Risciacquare l'embrione nella provetta contenente l'1% di agarosio a basso punto di fusione per tre secondi.
Posizionare l'embrione su un coperchio di plastica di Petri rovesciato con singole gocce di agarosio per montare ciascun embrione separatamente. Adagiare gli embrioni lateralmente nell'agarosio e mantenere questa posizione fino a quando l'agarosio non si è solidificato a temperatura ambiente. Coprire tutti gli embrioni montati nell'agarosio con mezzo uovo.
Metti gli embrioni incorporati sotto il microscopio stereoscopico e copri l'agarosio con acqua d'uovo. Impostare l'iniettore di pressione dell'aria con micro manipolatori, posizionandoli vicino ai microscopi. Utilizzare la bombola di gas in acciaio contenente azoto gassoso ad alta pressione come risorsa aria.
Una volta che gli embrioni sono stati montati nell'agarosio, aprire la valvola del gas. Durante l'utilizzo del modulo di riempimento frontale del microiniettore, caricare frontalmente l'ago di vetro preparato con due microlitri di miscela di anticorpi sul micro manipolatore. Ora sintonizza la pressione di ingresso su 80-90 libbre per pollice quadrato e la pressione di iniezione su 20 libbre per pollice quadrato.
Calibrare il volume di iniezione utilizzando un micrometro al microscopio. Impostare la durata del tempo di sintonizzazione in base alle dimensioni dell'apertura dell'ago da 10 a 120 millisecondi. Toccare la paletta per erogare ogni impulso di iniezione e regolare il volume di iniezione di ciascuna erogazione da quattro a cinque nanolitri.
Quindi colpire la punta dell'ago di microiniezione attraverso la piastra del tetto dorsale del cervello posteriore, posteriore al punto di cerniera zero-uno rondimere e iniettare circa 10 nanolitri di miscela di anticorpi senza colpire il tessuto cerebrale. Osservato il flusso di fluidi rossi nel ventricolo cerebrale. Dopo l'iniezione, rimuovere rapidamente la punta dell'ago dall'embrione ruotando la manopola del micromanipolatore.
Per un'iniezione di successo, il colorante rosso della miscela iniettata rimane stabilmente nel ventricolo cerebrale senza fuoriuscire nell'agarosio circostante. Spostare la piastra di montaggio sotto il microscopio per individuare un altro embrione montato in una posizione adatta per le ripetizioni. Dopo aver iniettato da sei a otto embrioni, sbucciare l'agarosio con un coltello microchirurgico per rilasciare gli embrioni dall'agarosio incorporato.
Trasferire gli embrioni microiniettati in un piatto fresco con 30 millilitri di terreno embrionale e metterli a temperatura ambiente per le fasi successive. Dopo 30 minuti, trasferire gli embrioni selezionati su 10 millilitri di terreno embrionale. Per montare gli embrioni, preparare agarosio a basso punto di fusione allo 0,8% contenente la stessa concentrazione di tricane nella provetta.
Utilizzare una pipetta di vetro per immergere gli embrioni iniettati nell'agarosio caldo per tre secondi. Quindi rimuovere immediatamente gli embrioni dall'agarosio con la stessa pipetta di vetro e posizionare gli embrioni al centro di piatti di coltura con fondo di vetro da 35 millimetri con una goccia di agarosio dal tubo. Orientare delicatamente gli embrioni con una sonda di fibre o una punta di carico per mantenere il lato dorsale del cervello embrionale il più vicino possibile al fondo di vetro.
Ruotare delicatamente la posizione dell'embrione per estendere l'embrione senza arricciarsi mentre l'agarosio si solidifica gradualmente. Successivamente, controlla la posizione dell'embrione capovolgendo il piatto inferiore di vetro. Assicurarsi che l'intero proencefalo dorsale con gli embrioni correttamente montati possa essere visto al microscopio.
Aggiungere da due a tre millilitri di mezzo embrionale preriscaldato a 28,5 gradi Celsius contenente tricane per coprire l'embrione. Posizionare correttamente il piatto sullo stadio a temperatura controllata del microscopio confocale e regolare la temperatura della camera di imaging a 28,5 gradi Celsius. L'embrione è ora pronto per l'imaging.
Gli embrioni iniettati con Atto-647N hanno mostrato fluorescenza di fondo nel ventricolo cerebrale. Gli embrioni di zebrafish iniettati anti-Dld-Atto-647N hanno mostrato grandi quantità di particelle fluorescenti internalizzate nella maggior parte delle cellule del proencefalo in via di sviluppo. L'imaging time lapse ha mostrato il movimento degli endosomi intracellulari Anti-Dld-Atto-647N durante la divisione cellulare.
La maggior parte dei progenitori della glia radiale mitotica ha mostrato segregazione asimmetrica anteriore o posteriore degli endosomi anti-Dld-Atto-647N in due cellule figlie. L'asimmetria si è stabilizzata verso la fine dell'anafase, con conseguente ereditarietà asimmetrica degli endosomi di segnalazione notch da parte delle cellule figlie in seguito. Assicurarsi che l'ago sia stato inserito nel ventricolo di marca nascosto nel posto giusto e controllare se ci sono perdite dopo la microiniezione.
Oltre alla marcatura della segnalazione notch delta, il protocollo è applicabile per la marcatura di altre proteine di membrana o proteine extracellulari utilizzando strategie simili, se è disponibile un buon anticorpo al dominio extracellulare.
