Si ringrazia il nucleo istologico del National Eye Institute (NEI) per l'utilizzo del sistema confocale Zeiss. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi IRP NEI (numero di sovvenzione ZIA EY000533-04).

Modellazione e analisi della degenerazione retinica

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

Nessuna divulgazione.

Questo protocollo fornisce un metodo per etichettare, visualizzare e quantificare in modo efficiente i depositi lipidici in modelli di malattia monogenica e poligenica in vitro per le malattie degenerative dell'occhio. Il software basato sull'intelligenza artificiale, LipidUNet, può essere applicato a tre marcatori lipidici comuni, APOE, Nile Red e BODIPY, e fornisce un metodo rapido e automatico per l'analisi che consente alla quantificazione di essere standard e imparziale.
La principale limitazione di LipidUNet è il fatto che il set di dati di addestramento per l'IA era limitato a immagini di ingrandimento 40x di cellule coltivate in una piastra a 96 pozzetti. Come risultato del set di immagini di addestramento, LipidUNet, nella sua forma attuale, è limitato all'analisi di immagini di ingrandimento 40x. Il software può essere utilizzato per analizzare immagini 40x di cellule coltivate su altre superfici di coltura oltre a una piastra da 96 pozzetti, ma è necessario prestare attenzione a esaminare le maschere di output generate per verificare la soglia accurata da parte del software. Saranno necessari più set di immagini (a diversi ingrandimenti) per espandere la portata di quali campioni / immagini può analizzare.
Il protocollo ha diversi passaggi critici. Nella fase del marcatore lipidico, l'utente deve confermare che il composto di etichettatura scelto (BODIPY, APOE, Nilo Red) ha etichettato il proprio campione in modo efficace. Le cellule RPE mature sono spesso fortemente pigmentate, il che può compromettere il segnale fluorescente dell'immunocolorazione anticorpale. Quando il segnale di fluorescenza è debole o quando c'è troppa colorazione di fondo, LipidUNet non è in grado di discernere con precisione le goccioline lipidiche. Per un motivo simile, è necessario utilizzare le impostazioni di acquisizione correttamente selezionate per la fase di imaging automatico del protocollo. Se le immagini acquisite sono di scarsa qualità, LipidUNet farà fatica a mascherare correttamente le immagini e, pertanto, la quantificazione sarà imprecisa (Figura 6A-L). Infine, la post-elaborazione delle immagini è un passo importante, in quanto LipidUNet ha requisiti specifici per il funzionamento del software.
Rispetto ai flussi di lavoro per l'analisi dei lipidi che utilizzano la soglia manuale o alle tecniche che comportano la soglia automatica in software come Fiji, LipidUNet offre una segmentazione imparziale e affidabile tra le immagini con deposizione lipidica variabile, come riflesso da un piccolo tasso di errore nell'identificazione delle particelle lipidiche (Figura 7). Il software consente all'utente di inserire ulteriori immagini di allenamento, consentendo l'analisi di set di immagini oltre a quelli che utilizzano un obiettivo di ingrandimento 40x o anche quelli che utilizzano un marcatore lipidico diverso, come indicato nel protocollo. In futuro, il software sarà addestrato ad analizzare immagini 3D in modo che sia possibile la quantificazione del volume dei depositi lipidici. Le malattie degenerative degli occhi che implicano la deposizione di lipidi come un importante contributo alla patologia sono prevalenti e si prevede che i casi aumenteranno man mano che la popolazione anziana si espande13. Modelli di malattia accurati e strumenti di analisi efficienti, come abbiamo delineato in questo protocollo, consentiranno lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici.

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule situato nella parte posteriore dell'occhio adiacente ai fotorecettori retinici. RPE svolge un ruolo vitale nel mantenimento di una corretta visione fornendo supporto metabolico e strutturale ai fotorecettori. Le cellule RPE sane sono caratterizzate da una morfologia esagonale distinta. Sono collegati da giunzioni strette, che consentono all'RPE di fungere da barriera tra il coriocapillare situato sul suo lato basale e i fotorecettori situati apicalmente. Per mantenere l'ecosistema retinico, RPE trasporta metaboliti chiave, ad esempio glucosio, ai fotorecettori in modo da ridurre al minimo il consumo di glucosio nell'RPE1. A causa di questa limitazione, RPE dipende da altri metaboliti per mantenere le loro esigenze metaboliche, compresi gli acidi grassi, che RPE converte in chetoni attraverso β-ossidazione2. Data la propensione dell'RPE a utilizzare acidi grassi, che sono probabilmente riciclati dalla digestione del segmento esterno dei fotorecettori (POS), come fonte di energia, cambiamenti dannosi nelle vie di elaborazione dei lipidi nell'RPE spesso portano a, o sono implicati in, malattie degenerative della retina sia monogeniche che poligeniche3.
La degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia degenerativa poligenica dell'occhio che causa la degenerazione RPE, è stata anche collegata all'autofagia aberrante e al metabolismo lipidico nel monostrato RPE. L'incapacità di un monostrato RPE disfunzionale di elaborare POS e svolgere altre funzioni critiche porta a depositi extracellulari (sub-RPE) chiamati depositi lineari basali (BLinD) situati tra l'RPE e la membrana di Bruch - un segno distintivo delle patologie AMD. I componenti principali di BLinD includono le lipoproteine, la più abbondante delle quali è l'apolipoproteina E (APOE)4. L'accumulo di strati sottili di BLinD può portare a drusen morbide, che è riconosciuto come un sintomo clinico di AMD 5,6.
Diversi gruppi hanno dimostrato che i modelli di malattia in vitro derivati da cellule staminali che causano disfunzione RPE presentano un accumulo lipidico sub-RPE 7,8,9. Hallam et al. (2017) hanno generato RPE derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iRPE) da pazienti ad alto rischio di AMD a causa di un polimorfismo del gene CFH. L'iRPE ha mostrato l'accumulo di drusen, come contrassegnato da APOE, e l'RPE ad alto rischio ha accumulato depositi più grandi rispetto all'iRPE generato da pazienti a basso rischio10.
Per creare un modello in vitro che ricapitola i segni distintivi cellulari dell'AMD, come le goccioline lipidiche e la deposizione di drusen, sono state stabilite linee iRPE generate da campioni di sangue dei pazienti utilizzando un protocollo11 guidato dallo sviluppo precedentemente pubblicato. Gli iRPE sono stati sottoposti a siero umano competente per il complemento (CC-HS), una soluzione contenente anafilautotossine che imitano una possibile causa di AMD: aumento della segnalazione del complemento alternativo8. La deposizione cellulare e subcellulare risultante di depositi lipidici è stata misurata utilizzando marcatori lipidici e lipoproteici comunemente usati, APOE, Nile Red e BODIPY. Attraverso questi marcatori, è stato dimostrato che la segnalazione attivata del complemento tramite CC-HS ha esacerbato l'accumulo di lipidi nelle cellule iRPE8.
Per sviluppare un modello di malattia per una malattia degenerativa retinica monogenica, sono state sviluppate linee iRPE da pazienti con malattia di Stargardt, una malattia causata da mutazioni del gene ABCA4 nella RPE. È stato precedentemente dimostrato che quando ABCA4 viene eliminato, la lipofuscina A2E, un deposito intracellulare noto per contenere alti livelli di fosfolipidi e prodotti di perossidazione lipidica dipendenti dalla luce, si accumula all'interno dell'RPE12. Le linee knockout ABCA4 sono state sviluppate insieme alle linee paziente ed entrambe sono state sottoposte ad alimentazione POS. L'iRPE Stargardt ha dimostrato una patologia indotta da fagocitosi POS, che mostra un aumento dell'accumulo lipidico quantificato dalla colorazione BODIPY. RPE derivato da ABCA4 KO iPSC sono stati sottoposti a trattamento CC-HS; la quantificazione del segnale BODIPY ha mostrato un difetto nella gestione dei lipidi anche nel modello di malattia di Stargardt9.
Data la prevalenza di queste malattie e la necessità di terapie efficaci, insieme ai modelli di malattia pertinenti sopra descritti, è necessario stabilire metodi solidi per quantificare l'efficacia dei potenziali trattamenti. Per quantificare i depositi lipidici in modo oggettivo, automatizzato e standardizzato, è stato creato un software basato sull'apprendimento automatico, LipidUNet, in modo che, se abbinato a strumenti di analisi della maschera, la deposizione lipidica possa essere identificata rapidamente ed efficacemente utilizzando i marcatori comuni Nile Red, BODIPY e APOE. Le statistiche riassuntive ottenute utilizzando questa pipeline di analisi possono quindi essere analizzate e visualizzate graficamente, consentendo un facile confronto delle condizioni di trattamento. Lo schema del protocollo è illustrato nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo: le cellule RPE vengono coltivate su una piastra a 96 pozzetti e sfidate con siero umano attivo o segmenti esterni bovini purificati per modellare diversi tipi di degenerazioni retiniche in vitro. Le cellule RPE sono fissate e colorate per i depositi di lipoproteine con Nilo Red, BODIPY e APOE. Un microscopio confocale viene utilizzato per acquisire Z-stack di particelle lipidiche marcate con fluorescenza, che vengono successivamente elaborate in proiezioni di massima intensità 2D. Un algoritmo di apprendimento automatico è stato addestrato per riconoscere e segmentare correttamente le particelle lipoproteiche. Vengono generate tabelle riassuntive contenenti il conteggio delle particelle e varie metriche di forma che possono essere utilizzate per la successiva rappresentazione grafica e analisi statistica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule esagonali situato nella parte posteriore dell'occhio. Fornisce nutrimento e supporto ai fotorecettori e ai capillari coroideali, esegue la fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori (POS) e secerne citochine in modo polarizzato per mantenere l'omeostasi della retina esterna. L'RPE disfunzionale, causata da mutazioni, invecchiamento e fattori ambientali, provoca la degenerazione di altri strati retinici e causa la perdita della vista. Una caratteristica fenotipica della degenerazione dell'RPE sono i depositi ricchi di lipidi intra e subcellulari. Questi depositi sono un fenotipo comune in diverse malattie degenerative della retina. Per riprodurre il fenotipo del deposito lipidico delle degenerazioni retiniche monogeniche in vitro, è stata generata RPE derivata da cellule staminali pluripotenti (iRPE) indotta dai fibroblasti dei pazienti. Le linee cellulari generate da pazienti con malattia da degenerazione retinica di Stargardt e ad esordio tardivo (L-ORD) sono state alimentate con POS per 7 giorni per replicare la funzione fisiologica RPE, che ha causato la patologia indotta dalla fagocitosi POS in queste malattie. Per generare un modello per la degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia poligenica associata all'attivazione del complemento alternativo, l'iRPE è stato sfidato con anafilatossine del complemento alternative. I depositi lipidici intra e subcellulari sono stati caratterizzati utilizzando rosso del Nilo, boro-dipirrometene (BODIPY) e apolipoproteina E (APOE). Per quantificare la densità dei depositi lipidici, è stato sviluppato un software basato sull'apprendimento automatico, LipidUNet. Il software è stato addestrato su immagini di proiezione a massima intensità di iRPE su superfici di coltura. In futuro, sarà addestrato ad analizzare immagini tridimensionali (3D) e quantificare il volume delle goccioline lipidiche. Il software LipidUNet sarà una risorsa preziosa per scoprire farmaci che riducono l'accumulo di lipidi nei modelli di malattia.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autore in primo piano: Svelare la patogenesi della degenerazione maculare legata all'età e scoprire potenziali terapie 

Metodo basato sull'apprendimento automatico di LipidUNet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando l'epitelio pigmentato retinico derivato da iPSC

In this study, we aim to understand the age-related macro degeneration pathogenesis and find the potential treatment for it. This semi-automated pipeline for lipid droplet analysis provides a robust system to study metabolism and aging diseases. Our lab focuses on finding drug targets for the treatment of AMD either using genetic or small molecule screens that aimed at reducing the accumulation of lipid deposits.

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro per identificare i depositi lipidici colorati da Nilo Red, BODIPY e APOE. Il software sviluppato è in grado di identificare e quantificare automaticamente i depositi lipidici e funziona meglio quando il protocollo delineato è ottimizzato. Sono inclusi esempi di RPE differenziato con successo (Figura 3A) e RPE scarsamente differenziato (Figura 3B), poiché la qualità del modello cellulare influisce notevolmente sulla qualità della corretta segmentazione dell'immagine.
Due dei tre marcatori descritti nel protocollo, Nile Red e BODIPY, sono identificati come piccoli punti circolari che sono distintamente luminosi nelle immagini fluorescenti (Figura 5 e Figura 6). Un'immagine "positiva" del protocollo sarebbe un'identificazione appropriata di questi depositi distinti (Figura 5A-D e Figura 5E-H). Un risultato "negativo" mostrerebbe una segmentazione errata dell'immagine scambiando la fluorescenza di fondo come un deposito, a causa di una debole colorazione (Figura 6A-C e Figura 6D-F) o a causa dell'elevata intensità dello sfondo (Figura 6G-I).
I depositi di APOE hanno una varietà di dimensioni e forme, apparendo più ovali o irregolari piuttosto che i depositi circolari di Nilo Red e BODIPY. Questi depositi sono anche meno puntati e l'intensità del segnale può differire tra i depositi a causa delle variazioni nella permeabilizzazione del campione. Una corretta identificazione identificherà ogni deposito, compresi quelli meno saturi (Figura 5I-L), mentre una segmentazione errata non raccoglierà questi depositi (Figura 6J-L). Pertanto, è importante ottimizzare i metodi di colorazione e imaging per evitare variazioni drastiche. Un modo per farlo è prestare particolare attenzione alle fasi di permeabilizzazione del campione durante l'immunocolorazione. Per ottimizzare il segnale fluorescente, le cellule possono essere lisate prima della fissazione e dell'immunocolorazione per l'APOE, il che si traduce in una saturazione uniforme e una migliore segmentazione dei depositi di APOE.
Vengono fornite anche immagini segmentate di cellule maturate su una piattaforma di coltura diversa da una piastra a 96 pozzetti. Il software LipidUNet è stato eseguito su immagini di cellule coltivate su un transwell, e mentre i depositi lipidici sono sogliati, lo sono anche i pori nella membrana transwell (Figura 6M-O). A causa della somiglianza nella forma e nelle dimensioni, il software LipidUNet nella sua forma attuale maschererà indiscriminatamente sia i depositi lipidici che i pori transwell.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Figura 5: Risultati rappresentativi. (A,E,I) Gli RPE placcati a 96 pozzetti sono colorati con colorazione nucleare di Hoechst (blu) e rosso Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (arancione) e sono le proiezioni di massima intensità di una pila Z. (B,F,J) Le immagini di input in scala di grigi per il software LipidUNet dopo l'elaborazione delle immagini. (C,G,K) Maschere generate da LipidUNet, dove tutti i depositi sono identificati correttamente. (D,H,L) I contorni di ogni particella mascherata sono numerati. Queste etichette consentono di collegare ogni particella nell'immagine a una voce nello spreadheet con i dati grezzi. (A-D) mostra la colorazione rosso del Nilo e il software è in grado di riconoscere accuratamente i depositi sullo sfondo nonostante un segnale più debole. (E-H) mostra un forte contrasto tra il segnale BODIPY e lo sfondo, che è l'ideale. LipidUNet identifica correttamente ogni deposito nell'immagine. (I-L) mostra un forte segnale APOE e rappresenta la variabilità della saturazione del segnale che si vede spesso con questa macchia. Tuttavia, la segmentazione delle immagini è in grado di identificare i confini di ciascun deposito APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Figura 6: Risultati non ottimali. (A,D,G,J,M) Gli RPE ben placcati a 96 sono colorati con colorazione nucleare Hoechst (blu) e rosso Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (arancione) e sono le proiezioni di massima intensità di uno Z-stack. (B,E,H,K,N) Le immagini di input in scala di grigi per il software LipidUNet dopo l'elaborazione delle immagini. (C,F,I,L,O) Le maschere errate generate da LipidUNet. I cerchi rossi indicano dove il software ha identificato erroneamente un deposito lipidico. (A-C) L'elaborazione del rosso Nilo non è corretta perché il software ha identificato la colorazione dello sfondo come un deposito. Questo può accadere più spesso quando c'è uno sfondo alto ma pochi depositi lipidici nell'immagine. Vengono mostrati due esempi di colorazione BODIPY: un'immagine di scarsa qualità dovuta alla debole colorazione BODIPY (D-F) e (G - I) un forte segnale BODIPY con sfondo elevato. In entrambi i casi, il software non è in grado di distinguere piccoli depositi lipidici circolari dall'anello circolare di fondo che circonda il nucleo. Mentre la colorazione e l'imaging dovrebbero essere ottimizzati per evitare questi errori, la versione più recente di LipidUNet è ampiamente migliorata per queste immagini. (J-L) Segmentazione APOE errata. Poiché i depositi sono più variabili per dimensioni e saturazione del segnale, il software ha difficoltà a riconoscere alcuni depositi. (M-O) RPE seminato su un transwell e colorato di rosso Nilo. Una fetta dello Z-stack è mostrata qui con entrambi i depositi lipidici rosso Nilo e pori transwell. Il software non è in grado di distinguere tra i due, come mostrato dal cerchio rosso contenente i pori transwell e dalla freccia verde che punta ai depositi rosso del Nilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Figura 7: Confronto tra gli strumenti maschera. (A,B,C) Gli RPE placcati a 96 pozzetti con quantità variabili di deposizione lipidica sono identificati con il rosso del Nilo (rosso). Le immagini sono mascherate utilizzando tre diversi metodi di mascheramento comuni, Find Maxima, Max Entropy e Renyi Entropy, e confrontate con la maschera generata da LipidUNet. L'immagine originale è accompagnata da un conteggio manuale dei depositi lipidici, mentre le maschere mostrano i conteggi previsti da ciascun metodo di segmentazione. Il tasso di errore medio è stato calcolato per ciascun metodo di segmentazione utilizzando la seguente formula: media[(|Conteggio previsto - Conteggio manuale|/Conteggio manuale) x 100]. La maschera generata da LipidUNet identifica più accuratamente i depositi lipidici attraverso le immagini con deposizione variabile rispetto ad altri metodi di mascheramento (tassi di errore medi: 23% LipidUnet, 1164% Trova massimi, 851% Entropia massima, 203% entropia Renyi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Numero di gatto</td>
			<td>Stock Conc.</td>
			<td>Conc. finale</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>MEM alfa</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>Supplemento N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>NA</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FBS inattivato dal calore</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>NA</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10mM</td>
			<td>0,01 mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Piruvato di sodio</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/mL</td>
			<td>100U/mL</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Taurina</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50mg/mL</td>
			<td>250ug/mL</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Idrocortisone</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18,1 mg / L</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0,013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Volume totale, mL</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione del reagente RPE-MM. Un elenco di reagenti e concentrazioni ottimali per RPE-MM.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies at JoVE.com

Le malattie degenerative dell'occhio che colpiscono lo strato di epitelio pigmentato retinico dell'occhio hanno origini monogeniche e poligeniche. Diversi modelli di malattia e un'applicazione software, LipidUNet, sono stati sviluppati per studiare i meccanismi della malattia, nonché potenziali interventi terapeutici.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

In questo studio, miriamo a comprendere la patogenesi della macro degenerazione legata all'età e trovare il potenziale trattamento per essa. Questa pipeline semiautomatica per l'analisi delle goccioline lipidiche fornisce un sistema robusto per studiare il metabolismo e le malattie dell'invecchiamento. Il nostro laboratorio si concentra sulla ricerca di bersagli farmacologici per il trattamento dell'AMD utilizzando screening genetici o di piccole molecole che mirano a ridurre l'accumulo di depositi lipidici.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

1.7K Views.  National Institutes of Health (NIH). In questo studio, miriamo a comprendere la patogenesi della macro degenerazione legata all'età e trovare il potenziale trattamento per essa. Questa pipeline semiautomatica per l'analisi delle goccioline lipidiche fornisce un sistema robusto per studiare il metabolismo e le malattie dell'invecchiamento. Il nostro laboratorio si concentra sulla ricerca di bersagli farmacologici per il trattamento dell'AMD utilizzando screening genetici o di piccole molecole che mirano a ridurre l'accumulo di d...

Video: Autore in primo piano: Svelare la patogenesi della degenerazione maculare legata all'età e scoprire potenziali terapie 

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

Ricerca

Biologia

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

To begin, dissolve Nile Red powder in acetone at three milligrams per milliliter concentration. Incubate the solution for 15 minutes at room temperature with periodic mixing. Filter the solution using a 0.22-micrometer filter once or twice depending on the amount of precipitate remaining in the solution.Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-500 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution to the paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate for 30 minutes at room temperature on a shaker protecting from light. After incubation, wash the samples twice with DPBS, then add 200 microliters of DPBS, and store them at four degrees Celsius.For BODIPY staining, prepare a 3.8-millimolar stock concentration by dissolving BODIPY in anhydrous DMSO. Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-300 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution of BODIPY to paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate overnight on a rocker at room temperature.The next day, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius. For APOE immunostaining, prepare a buffer solution by combining DPBS with 1%BSA, 0.5%Tween 20, and 0.5%Triton X-100. Block and permeabilize the paraformaldehyde-fixed RPE cells in 200 microliters of buffer solution for one hour.After incubation, add APPLE primary antibody diluted at one-to-100 in the buffer solution and incubate overnight at room temperature. The following day, wash the samples twice with DPBS. Then add 200 microliters of secondary antibody solution diluted at one-to-1000 for one hour at room temperature.After incubation, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius.

Colorazione dei depositi di epitelio pigmentato subretinico (RPE)

Image Processing of REP Deposits, Segmentation, and Quantification

Using a confocal microscope and a 40X objective, create a scan profile with the appropriate fluorescent channels for the lipid marker used. After setting up the acquisition mode and channels, optimize the focus strategy by clicking on Software Autofocus. Then set the range of the Z Stack to 20 microns.After this, optimize tiles and open the viewer to select the tile positions. Next, using a batch image processing method, create maximum projections of each Z Stack with the extended depth of focus method. Before exporting the images, set the compression to none and ensure original data is checked.The resulting image is a maximum projection gray scale TIFF of only the fluorescence channel, expressing the lipid marker. Identify the TIFF images representing either Nile Red, BODIPY, or APOE and move them into the Images folder within a directory named either Nile Red, BODIPY, or APOE, depending on the method being used. Open the lipid unit software.In the Predict tab, select the relevant directory by clicking on the ellipsis and navigating to the named directory. Confirm that lipid unit has identified the images correctly by checking the class entry. Click Predict to observe the task progress, then using the Mask Analysis tool, iterate through the generated masks and provide a quantitative count of the threshold lipid deposits from the mask images.Successful differentiation and maturation of RPE showed a confluent monolayer with pigmentation and polygonal morphology. In contrast, unsuccessful differentiation showed clusters of dying cells. In fluorescent images, Nile Red and BODIPY deposits appeared as small, bright circular points.A negative result shows incorrect image segmentation by mistaking background fluorescence as a deposit, either due to weak staining or high background intensity. APOE deposits varying in size, shape, and signal intensity and requiring optimization of staining and imaging methods to minimize variation are shown.