We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. materiale vegetale, condizioni di crescita, e Vegetativo clonazione Nota: Tre popolazioni tuberculatus sono stati studiati in questa ricerca: MCR (da McLean County, IL), ACR (da Adams County, IL), e WCS (da Wayne County, IL) (Tabella 1). <ol><li> Raccogliere e sospendere semi tuberculatus a 0,1 g agar L -1: soluzione di acqua a 4 ° C per almeno 30 giorni per migliorare la germinazione. Nota: Alcune popolazioni tuberculatus sono dormienti, ma questo passaggio aiuta a superare dormienza e rendere seme germogliare più uniforme. </li><li> Germinare semi di ciascuna popolazione tuberculatus (come in Tabella 1) in 12 x 12 cm vassoi contenenti un mezzo di impregnazione nella serra. <ol><li> Mantenere condizioni di serra a 28/22 ° C le temperature giorno / notte in un fotoperiodo 16/8 ore 12. </li><li> Supplemento luce naturale in serra con luce di lampade ad alogenuri mercurio per fornire un minimo di 500 mmol m -2 </sup&gt; flusso sec -1 fotoni a livello di impianto baldacchino. </li></ol></li><li> Trapianto emerso piantine quando sono alti in 80 cm 3 vasi nella serra di 2 cm. </li><li> Trapiantare le piantine in 950 cm 3 vasi contenenti un 3: 1: 1: 1 miscela di invasatura mix: terreno: torba: sabbia quando piantine sono alti 4 cm. Aggiungere 5 g di lento rilascio granuli fertilizzanti per ogni pentola e mescolare con questa miscela suolo. </li><li> Tagliare e rimuovere il meristema apicale contenente le tre foglie più giovani da 7 cm piante alte per eliminare dominanza apicale. Nota: Questo passaggio garantisce che ogni pianta crescerà abbastanza tre centimetri ascellari germogli da clonare. </li><li> Accise cinque germogli ascellari (3 cm di lunghezza) quando piantine sono circa 14 cm di altezza da ciascuna popolazione tuberculatus (come nella tabella 1). Rimuovere la maggior parte delle foglie su questi germogli ascellari per ridurre la perdita di acqua su ulteriore manipolazione, ma mantenere le due foglie più giovani per consentire l&#39;ulteriore crescita al trapianto. <br/&gt; Nota: Maneggiare con cura e cercare di non danneggiare i germogli durante la rimozione delle foglie. Etichettare ogni pianta con un palo. </li><li> Trapianto ascellare spara in 80 cm 3 pentole (una piantina per piatto) in mezzo di impregnazione, che è lo stesso mezzo utilizzato per la germinazione. Mezzo di impregnazione deve essere saturo inizialmente fino al modulo radici nella camera di crescita, quindi mantenere costanti umidità e pentole posto nella stanza di crescita per 7 giorni di tempo per mettere radici. Nota: Le piante sono molto sensibili a questo punto e non devono essere sottolineato. <ol><li> Mantenere la crescita condizioni della camera a 28/22 ° C le temperature giorno / notte in un fotoperiodo 16/8 ore 12. </li><li> Una combinazione di lampadine a incandescenza e fluorescenti può essere utilizzato per fornire luce nella camera di crescita e dovrebbe fornire almeno 550 mmol m-2 sec -1 flusso di fotoni a livello di impianto baldacchino 12. </li></ol></li><li> Trapianto di nuovo in 950 cm 3 pentole (una piantina per piatto) containing un 3: 1: 1: 1 miscela di invasatura mix: terreno: torba: sabbia (includere anche 5 g lento rilascio granuli di fertilizzante) quando le piante clonate sono alti 4 cm, poi trasferire di nuovo alla serra. </li><li> Clonare le piante una seconda volta utilizzando lo stesso metodo descritto sopra (cioè, passi ripetizione da 1.5 a 1.8, e poi passare al punto 2.1). Per un tipico studio a tempo-corso, generare cloni di almeno sei impianti indipendenti di ogni popolazione tuberculatus e li registra come linee MCR 1-6, ACR 1-6 e 1-6 WCS. <ol><li> Stabilire almeno sei &quot;madri&quot; linee clonali distinte per ripetere l&#39;esperimento e adeguatamente rappresentare la variabilità genetica all&#39;interno di ciascuna popolazione tuberculatus. </li><li> A seconda di quanto tempo punti verranno analizzati, generare abbastanza sub-cloni da ogni &quot;genitore&quot; linea clonale di condurre uno studio temporale corso. </li></ol></li></ol> 2. conducendo uno studio del metabolismo con asportati Waterhemp Foglie <ol><li> Accise le terze più giovani foglie (da 2 a 3 cm di lunghezza, 0,5 cm di includere picciolo attaccato) quando le piante tuberculatus clonate sono da 10 a 12 cm di altezza per il metabolismo di erbicidi e DT 50 analisi. </li><li> Piccioli fogliari taglio di ciascun impianto tuberculatus una seconda volta (in modo che 0.3 cm del picciolo rimane) sotto l&#39;acqua, e mettere questi estremità tagliate in 1,5 ml fiale di plastica (una foglia per flaconcino) 15. Nota: Tagliare una seconda volta sotto l&#39;acqua impedisce la formazione di bolle d&#39;aria e collegare vasi xilematici. <ol><li> In primo luogo, in parte immergere foglie escisse con il taglio picciolo nel buffer di pre-incubazione (200 ml) di 0,1 M Tris-HCl (pH 6) per 1 ora. </li><li> In secondo luogo, spostare ogni foglio in un flacone contenente 1,5 ml di tampone di incubazione (200 ml) di 0,1 M Tris-HCl (pH 6) più 150 pM [URL- 14 C] erbicidi, e incubare a 28 ° C per 1 ora a consentire l&#39;assorbimento erbicidi nelle foglie. Nota: Entrambi i 14 C-mesotrione e <sup&gt; 14 C-primisulfuron-metile sono stati utilizzati nei nostri studi a specifiche attività di circa 20 mCi mmol -1. Sia diffusione e assorbimento attraverso il flusso xilematica traspirabilità contribuiscono alla quantità di erbicida ripreso per foglia. Nota: L&#39;effetto di inibitori metabolici sul metabolismo erbicida può essere determinata modificando passi 2.2.1 e 2.2.2. Aggiungere 100 mM dell&#39;inibitore al buffer pre-incubazione e lasciate incubare per 2 ore, poi il trasferimento a tampone di incubazione con erbicida ed ancora aggiungere 100 pM inibitore. Ad esempio, malathion e tetcyclacis inibiscono alcune attività del citocromo P450 in impianti di 15-17. </li><li> Lavare la parte immersa di foglie asportati con acqua deionizzata e trasferire foglie escisse per un quarto di forza Murashige e Skoog (MS) sali soluzione (500 ml) per 0 ore, 5 ore, 11 ore, 23 ore o 35 ore, rispettivamente, nella camera di crescita per lo studio del metabolismo tempo portate. </li></ol></li><li> Vendemmia rimuovendo congedos dalla soluzione di incubazione al punto di tempo appropriato e macinare manualmente ogni tessuto fogliare in azoto liquido utilizzando un tubo di polipropilene (15 ml) e pestello di vetro. </li><li> Estrarre erbicidi radiomarcato e dei suoi metaboliti di ciascun foglio con 7 ml di 90% acetone con un omogeneizzatore tessuto laboratorio nella stessa provetta di polipropilene come sopra. Risciacquare omogeneizzatore tessuto con un ulteriore 7 ml di 90% di acetone, e continuare per omogeneizzare fino tessuto è completamente polverizzato (di solito circa 2 min). Nota: 90% acetone può essere utilizzato per l&#39;estrazione della maggior erbicidi dai tessuti vegetali. Tuttavia, se questo metodo non è in grado di estrarre più del 90% dei composti radiomarcati assorbite, poi metanolo al 90% o 90% acetonitrile possono essere sostituiti come solvente di estrazione. </li><li> Label 90% estratti acetone (14 ml totali) e conservare a -4 ° C per 16 ore per consentire l&#39;estrazione supplementare a verificarsi. Nota: Seguendo questa estrazione di foglie trattate, la quantità di rad estraibiliioactivity è tipicamente almeno il 98% di composti radiomarcati assorbite dalla foglia trattata. La radioattività non estraibili (residui legati) nelle foglie asportato in media solo dello 0,3% in tutti i punti di tempo nel nostro precedente studio di 12, ma questa cifra può variare a seconda all&#39;erbicida utilizzato e punto di tempo esaminato. </li><li> Centrifugare i campioni a 5.000 xg per 10 minuti e concentrarsi supernatanti a 40 ° C con un evaporatore rotante fino ad un volume finale di 0,5 ml si ottiene. Trasferire questo volume di un tubo di plastica 2,0 ml. </li><li> Aggiungere acetonitrile: acqua (1: 1 in volume) per regolare il volume finale della pianta estratti 1,25 ml e ri-centrifugare a 10.000 xg per 10 minuti per rimuovere eventuali particelle. </li><li> Misurare la radioattività totale in un&#39;aliquota prelevata su ogni campione (dpm microlitri -1) mediante spettroscopia scintillazione liquida (LSS) 12 e normalizzare quantità di [14 C-marcato] composti iniettati per l&#39;analisi HPLC (per esempio, 10,000 totale dpm / campione / run) in modo da assi Y sarà uniforme tra campioni durante la rappresentazione grafica dei risultati. </li></ol> 3. Analisi HPLC di erbicidi metabolismo in fogli escisse Nota: Risolvere totale radioattività estraibile in erbicidi genitore e erbicidi metaboliti utilizzando le seguenti condizioni RP-HPLC 12. <ol><li> Eseguire RP-HPLC con una colonna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 micron dimensione delle particelle per HPLC analitico) ad un flusso di 1 ml min -1 per la maggior parte degli erbicidi non polari. Nota: colonne C 4 o C 12 RP-HPLC possono anche essere utilizzati per ottimizzare la separazione dell&#39;erbicida madre dai suoi metaboliti. Un filtro precolonna e / o precolonna possono anche essere usati per proteggere e prolungare la durata della colonna RP. <ol><li> Utilizzare la seguente fase mobile per RP-HPLC: Eluente A, 0,1% di acido formico (v / v) in acqua, e Eluente B 100% HPLC acetonitrile. Nota: HPLC-grade metanolo può essere utilizzato anche come Elconfluente B per la risoluzione di composti più polari e metaboliti, ma essere consapevoli del fatto che i tempi di ritenzione possono anche cambiare. Nota: Il profilo di eluizione utilizzato per risolvere mesotrione o primisulfuron-metil dai loro metaboliti polari nella nostra ricerca 12 è: Fase 1, A: B (4: 1, v / v) di A: B (3: 2, v / v ) in un gradiente lineare (12 min); Fase 2, A: B (3: 2, v / v) di A: B (3: 7, v / v) in un gradiente lineare (5 min); Fase 3, A: B (3: 7, v / v) di A: B (1: 9, v / v) in un gradiente lineare per 2 min (per un totale di 19 min). Nota: Le sfumature e passaggi isocratiche possono avere bisogno di essere regolato in base alle proprietà fisiche del materiale di base, al fine di ottimizzare la risoluzione. </li><li> Seguire la procedura sopra gradiente lineare con A: B (1: 9, v / v) a A: B (4: 1, v / v) in un gradiente lineare (3 min) e A: B (4: 1, v / v) step isocratica (per almeno 2 minuti) per riequilibrare colonna RP prima di iniettare il successivo 12 estratto. </li></ol></li><li> Rilevare e visualizzare composti radiomarcati con un flusso Scintillation Analyzer. Registrare la quantità di genitore erbicidi rimanente in ciascun campione come percentuale della radioattività totale in ciascun campione (rilevati e quantificati dalla portata scintillazione Analyzer secondo le istruzioni del produttore) per determinare i tassi di metabolismo erbicidi in ciascuna popolazione tuberculatus durante il corso del tempo. </li></ol> 4. Procedure statistiche <ol><li> Disporre trattamenti in un design completamente randomizzati (o dispositivo adatto per l&#39;analisi statistica). </li><li> Eseguire due esperimenti indipendenti con ogni trattamento, composto da tre repliche biologiche per ogni esperimento. I due esperimenti indipendenti includono sei repliche biologiche in totale. Se l&#39;effetto esperimento non è significativo (α = 0,05), combinare e analizzare dati da ciascun esperimento indipendente. Se l&#39;effetto è significativo esperimento, quindi analizzare ogni esperimento separatamente. Nota: Includere i primi tre repliche biologiche in Esperimento 1 e per i prossimi tre repliche biologiche in Esperimento 2. Ogni replica biologica rappresenta un &quot;genitore&quot; distinta linea clonale derivata da ciascuna popolazione (MCR 1-6, 1-6 ACR, e WCS 1-6) in modo che ogni tempo- Analisi corso utilizza piante geneticamente identici. I due esperimenti indipendenti includono sei repliche biologiche in totale, che permette per una rappresentanza adeguata della variabilità genetica e la determinazione di un valore mediano DT 50 per ogni popolazione tuberculatus. </li><li> Analizzare i dati con almeno analisi di regressione non lineare e inserirli con una curva semplice del primo ordine al fine di stimare DT 50 s. L&#39;equazione che segue descrive il modello: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> dove in questo modello y rappresenta la percentuale dell&#39;erbicida genitore rimanente al tempo t, μ i è il DT 50 per ciascuntuberculatus popolazione i, e il parametro C 0 è la quantità stimata di genitore erbicida presente at = 0 12. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il metodo espunto-foglia qui descritto è stato utilizzato in precedenza nella ricerca metabolismo primisulfuron nel mais lascia 15, ma i nostri risultati dimostrano che questo protocollo è anche efficace, preciso e riproducibile per misurare il metabolismo erbicidi in una specie infestanti dicotiledoni 12. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato rispetto studi intero impianto è che un foglio asportato è indipendente intero impianto modelli traslocazione di postemergence, erbicidi...

Resistenza agli erbicidi in erbacce presenta una grave minaccia per la produzione mondiale di cibo e fibre 1,2. Attualmente, migliaia di popolazioni e biotipi resistenti provenienti da oltre un centinaio di specie infestanti in tutto il mondo sono stati documentati e studiati 3. Un meccanismo importante che conferisce resistenza agli erbicidi nelle piante è l&#39;alterazione di erbicidi geni e proteine ​​bersaglio del sito, tra cui le mutazioni genetiche che colpiscono erbicida di proteine ​​cinetica vincolanti o l&#39;amplificazione del target loco gene 2. Disintossicazione metabolica attraverso attività elevati di citocromo P450 monoossigenasi (P450) o glutatione S -transferase (GST) enzimi è un altro meccanismo che conferisce resistenza agli erbicidi in piante infestanti, che è distinto in diversi modi dai meccanismi bersaglio posto a base 2. Resistenza a base metabolica ha ramificazioni significative per se i costi dell&#39;impianto di fitness (aka sanzioni fitness) possono derivare dalle mechanis erbicidi resistenzam, nonché per quanto riguarda il potenziale di un singolo meccanismo di disintossicazione per conferire resistenza incrociata o multiplo erbicidi nelle popolazioni infestanti 1,2,4. Generalmente, il metabolismo erbicidi nelle piante può essere suddiviso in tre fasi distinte 5. Fase I implica la conversione erbicidi o l&#39;attivazione come idrossilazione P450-mediata di anelli aromatici o gruppi alchilici, o da N - o reazioni dealchilazione O-, con conseguente aumento di polarità e erbicida parziale disintossicazione 5,6. Recentemente introdotto gruppi funzionali in fase I in grado di fornire i siti di collegamento per la coniugazione di glutatione ridotto da GST o di glucosio da parte glicosiltransferasi UDP-dipendenti in fase II 5,7. Ad esempio, il principale metabolita iniziale di primisulfuron-metile in mais è idrossi-primisulfuron-metil 8, che può essere ulteriormente metabolizzato a idrossi-primisulfuron-glucoside (Fase II) e poi trasportato al vacuolo per l&#39;archiviazione a lungo termine o ulteriori metabolica professionistaelaborazione 5,6 (fase III). Tuberculatus (Amaranthus tuberculatus) è un difficile da controllare, dicotiledoni specie infestanti annuali che ostacola la produzione di mais (Zea mays), soia (Glycine max), e cotone (Gossypium hirsutum) negli Stati Uniti. L&#39;elevato grado di diversità genetica delle tuberculatus è facilitata dalla sua biologia dioica e lunga distanza l&#39;impollinazione vento, e un singolo impianto tuberculatus femmina può produrre fino a un milione di semi 9. Questi semi sono piccoli e facilmente diffondersi, che naturalmente dotare tuberculatus con un meccanismo di dispersione efficace. Tuberculatus mostra la germinazione continua per tutta la stagione di crescita 9, ei suoi semi sono in grado di germinare dopo diversi anni di dormienza. Tuberculatus è una pianta C 4 che possiede un tasso di crescita superiore alla maggior parte infestanti a foglia larga nei sistemi a seminativo 10. Inoltre, numerose popolazioni tuberculatus sono resistenti alla fam multiplailies di erbicidi 3. Una popolazione di tuberculatus (designato MCR) da Illinois è resistente 4-idrossi-phenylpyruvate diossigenasi (HPPD) erbicidi -inhibiting 11, come mesotrione, nonché atrazina e acetolattato sintetasi (ALS) -inhibiting erbicidi, compresi primisulfuron-metil , a causa della non-bersaglio-site meccanismi basati 12,13. Una diversa popolazione di tuberculatus designato ACR 14, che è primisulfuron-metil-resistenti (a causa di una mutazione nel gene ALS) e atrazina resistente ma sensibile al mesotrione, e una popolazione tuberculatus designato WCS 14 che è sensibile alla primisulfuron-metile, mesotrione, atrazina e sono stati utilizzati in confronto con MCR nella nostra ricerca anteriore 12 ed esperimenti correnti (riassunti nella Tabella 1). Gli studi iniziali non hanno rilevato alterazioni nei livelli di sequenza genica HPPD o di espressione, o ridotto mesotrione captazione, nel MCRpopolazione se confrontato con le popolazioni mesotrione sensibili 12. Tuttavia, studi sul metabolismo con piante intere dimostrato significativamente più bassi di mesotrione genitore erbicidi in MCR rispetto al ACR e WCS, che correlata con le risposte fenotipiche precedenti per mesotrione 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tuberculatus Popolazione </td><td> Abbreviazione </td><td> Fenotipo a Mesotrione </td><td> Resistenza mesotrione Meccanismo </td><td> Fenotipo a primisulfuron </td><td> Resistenza primisulfuron Meccanismo </td></tr><tr><td> McLean County-resistente </td><td> MCR </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo * </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo </td></tr><tr><td> Adams County-resistente </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Resistente </td><td> Obiettivo-site mutazione in SLA 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensitive </td><td> WCS </td><td> Delicato </td><td> - </td><td> Delicato </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Meccanismi di resistenza non-bersaglio-site, diversi metabolismo potenziato, può anche conferire resistenza mesotrione nella popolazione MCR 12. Tabella 1: Descrizione delle popolazioni tuberculatus da Illinois utilizzati in questo studio. Oltre a determinare i tassi di metabolismo erbicida piantine tuberculatus intatti, un approccio sperimentale diverso è stato sviluppato e impiegato nella nostra precedente ricerca per indagare il metabolismo utilizzando un tuberculatus asportato foglia saggio 12, nonché vari inibitori P450 (ad esempio, tetcyclacis e malathion). Questo metodo è stato adattato appositamente per tuberculatus da un previinvestigazione unità organizzative del metabolismo primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15, dal momento che il test foglia asportato non era ancora stata segnalata per condurre ricerche metabolismo diserbante in un impianto dicot. L&#39;insetticida malathion organophophosate è stato spesso utilizzato per in vivo e in vitro, la ricerca erbicidi metabolismo per indicare il coinvolgimento P450 16. Per esempio, la tolleranza e rapido metabolismo del mesotrione nel mais sono dovuti a idrossilazione anello P450-catalizzata, che è stata verificata quando malathion maggiore sensibilità mais mesotrione 17. Allo stesso modo, malathion inibito il metabolismo della SLA inibitore primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato è che i dati generati sono indipendenti modelli traslocazione intero impianto, un fattore importante da considerare quando si valuta metabolismo sistemico, erbicidi postemergence nelle piante. Di conseguenza, questo metodo consente quantitativa emetabolica analisi qualitative di concentrarsi su una singola foglia trattata 12. Una strategia di clonazione vegetativa, in combinazione con il protocollo foglio asportato, è stato precedentemente utilizzato in tuberculatus condurre studi sul metabolismo 12. A causa della natura outcrossing di tuberculatus (separati per uomini e piante femminili), e alto grado di diversità genetica all&#39;interno delle specie dioica Amaranthus 9, questo protocollo ha assicurato che piantine tuberculatus geneticamente identici sono stati analizzati entro gli esperimenti time-corso. Questo articolo illustra l&#39;utilità del metodo di foglia asportato per misurare i tassi di metabolismo erbicidi in una pianta infestante dicot (tuberculatus). La quantità di erbicida genitore restante è stato determinato in ogni momento (Figura 1) da almeno analisi di regressione non lineare, e si forma con una curva semplice primo ordine per stimare il tempo per il 50% di erbicidi assorbita a degradare ( DT 50). Rappresentantecromatogrammi di fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) vengono visualizzati per la SLA-resistenti e delle popolazioni tuberculatus sensitive, che indicano la scomparsa di erbicidi genitore e formazione concomitante del metabolita polare (s) nel corso di un periodo di studio-corso (Figura 2). Il focus del nostro articolo è quello di descrivere e dimostrare l&#39;utilità del test foglia asportato in combinazione con un metodo di clonazione vegetativo per determinare i tassi di precise e riproducibili del metabolismo erbicidi nelle piante dicotiledoni, utilizzando uniformemente anello marcato (URL- 14 C) erbicidi tre popolazioni tuberculatus che si differenziano per le loro risposte integrali vegetali HPPD- e SLA-inibitori erbicidi (Tabella 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Grandi differenze nei tassi di metabolismo mesotrione sono stati rilevati tra una WCS o ACR e MCR (Figura 1). Ad ogni punto di tempo, MCR ha metabolizzato mesotrione più rapidamente delle due popolazioni mesotrione sensibili, WCS e ACR, che è correlato con precedenti intero impianto risposte fenotipiche 11. Clonando abbastanza piante da una pianta parentale singolo da ciascuna popolazione, metabolismo erbicida analisi volta portate sono uniformi e riproducibili a causa della mancanza di var...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Misurare Tassi di erbicida Metabolismo in Dicot Erbacce con un saggio asportati Foglia

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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11.9K Views.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

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Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Flussi di minerali nutrienti e sostanze tossiche in misura Piante con traccianti radioattivi

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

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Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protocolli per Robust erbicidi Test della resistenza in diversi Weed Specie

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS Analisi delle piastrine umane come una piattaforma per lo Studio del metabolismo mitocondriale

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

Laboratorio e campo protocollo per la stima di tassi di erosione del foglio da Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

Un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

Stimare i tassi di denitrificazione sedimento utilizzando core e N2O microsensori

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Stima dell'indice dell'area foglia utilizzando tre metodi distinti in stand deciduous puro

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a non-targeted approach, plant metabolites and xenobiotics of interest are identified and localized in plant tissues to uncover&#160;specific distribution patterns. Then, in silico prediction of potential metabolites (i.e., catabolites and conjugates) from the identified xenobiotics is performed. When a xenobiotic metabolite is located in the tissue, the type of enzyme involved in its alteration by the plant is recorded. These results were used to describe different types of biological reactions occurring in S. alba leaves in response to xenobiotic accumulation in the leaves. The metabolites were predicted in two generations, allowing the documentation of successive biological reactions to transform xenobiotics in the leaf tissues.

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

This method uses mass spectrometry imaging (MSI) to understand metabolic processes in S. alba leaves when exposed to xenobiotics. The method allows the spatial localization of compounds of interest and their predicted metabolites within specific, intact tissues.

Indagine sul metabolismo degli xenobiotici nelle foglie di Alba Salix tramite imaging della spettrometria di massa

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...