Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull'insieme di proteine che si esprimono sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, il numero, la localizzazione subcellulare e la composizione subunità di queste proteine sono controllati dinamicamente. Qui, useremo un approccio di alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di recettori espressi in superficie nelle colture cellulari, purché riprenda l'internalizzazione e il riciclaggio.
Si tratta di un protocollo molto versatile, che fornisce informazioni meccaniche sulla regolazione delle proteine espresse in superficie. Nel nostro esempio, studieremo i recettori della glutammina nei neuroni ippocampali primari. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina che possiede un epitopo extracellulare anagenico, se gli anticorpi non sono disponibili, la trasvezione di costrutti taggati può essere utile sia per l'etichettatura che per lo studio di mutazioni specifiche.
Nei nostri esempi, usiamo anticorpi contro il GluA1 endogeno, e taggato Glu12 B.To iniziamo questa procedura, trasferiamo il lato cellulare della copertura fino a un vassoio coperto di pellicola di paraffina, per salvare i reagenti e facilitare la manipolazione. Salvare e mantenere i supporti condizionati a 37 gradi Celsius per le fasi di incubazione e lavaggio. Incubare le cellule con anticorpi primari diluiti in mezzi condizionati, a temperatura ambiente, per 15 minuti.
Successivamente, utilizzare una pipetta sottovuoto per aspirare con cura l'anticorpo contenente mezzi e lavare le cellule tre volte con mezzi condizionati. Se si studia l'espressione del recettore della superficie rispetto a quella intracellulare, fissare le cellule con paraformaldeide dopo questo passaggio, come delineato nel protocollo di testo. Mantenere le cellule in mezzi condizionati senza anticorpi e restituirle all'incubatrice a 37 gradi Celsius per consentire l'internalizzazione.
Se si studia il processo di internalizzazione, correggere le celle con paraformaldeide dopo questo passaggio, come indicato nel protocollo di testo. Per bloccare gli epitopi sull'anticorpo primario attaccato alla superficie espresso recettori che non sono stati internalizzati, incubare cellule con frammenti anticorpali Fab anti-IgG non coniugati diluiti in mezzi condizionati, per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo questo, lavare le cellule tre volte con mezzi condizionati.
Incubare i pozzi lavati con mezzi condizionati contenenti 80 micromolare Dynasore, a 37 gradi Celsius, per consentire il riciclo dei recettori internalizzati. Dopo aver terminato le modifiche sulle cellule vive, lavare le cellule una volta con PBS plus. Aggiungere alle cellule una soluzione di paraformaldeide e 4% di saccarosio in PBS e incubare in una cappa aspirante a temperatura ambiente per sette-otto minuti, per fissare le cellule.
Quindi lavare le cellule tre volte con PBS normale. Aggiungere una soluzione di siero di capra normale al 10% in PBS alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per bloccare siti di legame non specifici. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi secondari contrassegnati fluorescentmente diluiti in 3%NGS in PBS a temperatura ambiente per un'ora, per etichettare i recettori delle etichette degli anticorpi primari.
Dopo questo, lavare le cellule tre volte con PBS. Per iniziare a etichettare i recettori intracellulari, aggiungere una soluzione dello 0,25%TritonX in PBS e incubare a temperatura ambiente per cinque-10 minuti, per permeabilizzare le cellule. Quindi blocca con 10%NGS a temperatura ambiente per 30 minuti.
Se si studiano superficie rispetto al totale, incubare le cellule con lo stesso anticorpo primario utilizzato in precedenza, diluite con 3%NGS in PBS, a temperatura ambiente per un'ora, per etichettare i recettori intracellulari. Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS. Etichetta con secondo anticorpo secondario contrassegnato fluorescentmente, diluito in 3%NGS in PBS, a temperatura ambiente per un'ora.
Dopo questo lavare le cellule tre volte con PBS. Posizionare prima delicatamente i coperchi, lato cella verso il basso, su 12-15 microlitri del supporto di montaggio appropriato per montare le celle. Quindi immagini le celle sul microscopio confocale appropriato e analizza le celle come delineato nel protocollo di testo.
Questo protocollo per studiare il traffico del recettore del glutammato si basa sull'etichettatura differenziale dei recettori, espressa sulla superficie cellulare, e di quelli espressi nelle membrane interne. Dopo aver acquisito immagini confocali, il segnale fluorescente può essere facilmente quantificato per mostrare un aumento dell'espressione superficiale, rispetto alla popolazione intracellulare, a seguito di LTP chimico. Nessun segnale per PSD-95 può essere ottenuto in cellule non permeabilizzate, dimostrando l'integrità della membrana plasmatica.
Ciò indica che il segnale ottenuto per la superficie GluA1 corrisponde effettivamente ai recettori espressi in superficie. È importante sottolineare che un segnale minimo per il GluA1 interiorizzato può essere osservato in condizioni di non permeabilizzazione, dimostrando che tutti gli epitopi superficiali sono occupati dal ciclo iniziale di etichettatura degli anticorpi. Vengono quindi identificati i recettori che sono stati internalizzati.
Questo esempio evidenzia che la fosforilazione GluN2B a S1480 promuove l'internalizzazione del recettore. Poiché il mutante fosfomimetico S1480E mostrava un rapporto di internalizzazione molto più elevato rispetto ai recettori di tipo selvaggio. Come previsto, non viene ottenuto alcun segnale per i recettori internalizzati nel controllo.
Successivamente, vengono identificati recettori riciclati e recettori internalizzati. Il rapporto di riciclaggio generato mostra che GluN2B S1480E non ha alcun effetto sul riciclaggio NMDAR. Nel controllo, un segnale forte può essere osservato per la superficie espressa GluN2B in assenza di blocco Fab.
Questo segnale scompare nelle colture trattate da Fab, dimostrando che il protocollo di blocco è sufficiente per bloccare completamente gli epitopi espressi in superficie, e che i segnali superficiali osservati dopo il riciclaggio corrispondono effettivamente ai recettori trafficati verso la membrana plasmatica. L'attuale protocollo è solo uno dei metodi disponibili per studiare la regolazione delle proteine espresse in superficie. Altri approcci possono essere adottati per espandere o verificare i dati ottenuti qui.
Questi includono metodi biochimici, come la biotinylation, le tecniche di imaging della vita o approcci funzionali, come l'elettrofisiologia o l'imaging del calcio. Usiamo pfa per congelare la localizzazione dei recettori, tuttavia PFA è un noto cancerogeno, quindi è fondamentale eseguire passaggi utilizzando PFA sotto una cappa aspirante, mentre si indossano DPI appropriati.
