La biologia dei sistemi offre informazioni sulle reti biologiche e sui meccanismi nei modelli di infezione, mentre la biologia sintetica consente una terapia di precisione. Stiamo esplorando l'immunometabolismo nell'infezione da Leishmania e il potenziale dei circuiti biosintetici per la risoluzione della malattia, rivoluzionando l'immunoterapia. Negli ultimi anni, la biologia sintetica si è dimostrata molto promettente verso lo sviluppo di strategie più nuove ed efficaci per combattere la leishmaniosi.
Alcuni degli sviluppi recenti riguardano l'ingegnerizzazione di citochine sintetiche, il circuito sintetico bistabile CRISPR-Cas9 e i peptidi sintetici sono oggetto di studio come terapie. Il nostro protocollo ha come bersaglio la proteina ospite, che viene modulata dal parassita per la sua sopravvivenza. Così studiamo l'effetto sul circuito non solo sul parassita, ma anche sull'ospite.
Inoltre, abbiamo studiato l'effetto del circuito sintetico sull'indirizzamento della funzione di ortogonalità e modularità al momento della consegna nell'host. Per iniziare, su un computer, apri il software TinkerCell e fai clic sulla scheda delle parti. Seleziona il componente del promotore del CMV dalla libreria e posizionalo sulla tela per simboleggiare il promotore del citomegalovirus all'interno del circuito sintetico.
Quindi recuperare il sito di legame del repressore analogo all'operatore della tetraciclina e posizionarlo adiacente al promotore sulla tela, integrandolo con il promotore CMV. Trascina e rilascia i siti di ingresso interni dei ribosomi e la regione codificante sulla tela, integrandoli con i componenti genetici esistenti. Rinominare la regione codificante come repressore responsivo alla tetraciclina.
Unisci questi elementi genetici per facilitare la costruzione delle parti sintetiche. Incorporare sulla tela una regione distanziatrice tagliabile dal teschovirus suino 12A. Introdurre un'ulteriore regione codificante, la succinato deidrogenasi o SDHA, che rappresenta il gene di interesse nel costrutto sintetico e lo integra con gli altri elementi.
Adiacente alla regione codificante SDHA, integrare un'altra regione spaziatrice scissa dalla proteasi cellulare teschovirus suino 12A. Introdurre una regione codificante che rappresenta il gene reporter ed etichettarla come GFP nel costrutto. Accanto a GFP, aggiungi un carattere di terminazione.
Per verificare la formazione di un circuito genetico funzionale, fare clic su qualsiasi parte del circuito. Il circuito appare rosso al clic. Dalla scheda di reazione, assegnare i tassi di regolazione al repressore sensibile alle tetracicline, SDHA e GFP per delineare la reazione di traduzione all'interno del circuito sintetico.
Aggiungi una piccola molecola dalla scheda delle parti e chiamala doxiciclina. Per assegnare una funzione d'onda alla doxiciclina, dalla scheda parti e connessione, selezionare l'ingresso e fare clic sull'ingresso dell'onda. Dalla scheda reazione, fai clic su reazione di repressione.
Trascina e rilascia la velocità di reazione sulla tela tra dox e repressore reattivo alla tetraciclina. Per impostare la cinetica di reazione tra dox e repressore responsivo alla tetraciclina, fare doppio clic sull'icona della funzione d'onda su dox e regolare doxycycline.sin. ampiezza a 10.
Per implementare la reazione regolatoria trascrizionale tra la proteina repressore sensibile alla tetraciclina e il sito di legame del repressore, selezionare la reazione dalla scheda di reazione e posizionarla sulla tela tra il repressore responsivo alla tetraciclina e l'operatore della tetraciclina. Fare doppio clic su ciascun componente e reazione per impostare una concentrazione iniziale e un parametro per la simulazione. Fare clic su simulazione, scegliere deterministico e simulare il circuito per 100 unità di tempo.
Regola il grafico di simulazione dal pannello di controllo e osserva il modello grafico per SDHA e proteine repressive sensibili alle tetracicline. Apri il registro delle parti biologiche standard, quindi clicca su cerca e inserisci il nome della componente genetica. Per ottenere la sequenza nucleotidica del promotore CMV, fare clic sulla sequenza di recupero della parte e salvare il file come file di testo.
Per ottenere la sequenza codificante la proteina di SDHA, apri NCBI e scegli nucleotide dal menu a discesa accanto alla finestra di ricerca. Digita la succinato deidrogenasi e il Mus musculus e cerca la sequenza nucleotidica. Fare clic sull'opzione CDS per ottenere la sequenza di codifica di SDHA e salvare la sequenza in un file di testo.
Unisci in sequenza la sequenza nucleotidica di tutte le parti regolatorie genetiche in un unico file. Aggiungere un codone di inizio ATG subito dopo la sequenza di Kozak e rimuovere i codoni di stop interni per evitare la formazione di polipeptidi nascenti. Apri il sito Web Expasy e incolla la sequenza nucleotidica.
Fare clic sull'opzione traduci la sequenza, quindi selezionare cinque primi tre primi fotogramma uno e rimuovere i codoni di stop. Per iniziare, coltivare le cellule RAW264.7 a 37 gradi Celsius fino a raggiungere il 90% di confluenza. Preparare i seguenti campioni per determinare l'effetto di eliminazione dei parassiti del circuito sintetico indotto.
Raschiare le celle RAW264.7 da un pallone da 25 centimetri quadrati. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti e risospendere il pellet in un millilitro di terreno completo DMEM. Trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare risospesa in un tubo da 100 microlitri.
Aggiungere 10 microlitri di blu di tripano allo 0,5% alle cellule e mescolare bene. Caricare 10 microlitri di miscela di cellule e tripano blu sul vetrino della camera di conteggio delle cellule e prelevare la conta delle cellule da quattro camere. Piastra due volte 10 alla potenza di quattro celle per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con fondo a vetrino coprioggetto e incubazione a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Per preparare un campione infetto di sei ore, centrifugare un millilitro di promastigoti di Leishmania major in fase stazionaria a 7, 273G per 10 minuti e risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno completo DMEM. Dopo il conteggio, aggiungere due volte 10 alla potenza di cinque promastigoti L.major nella piastra a 96 pozzetti inferiore del vetrino coprioggetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sei ore.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS. Per preparare i campioni IMT e IMTI, crescere due volte 10 alla potenza di cinque promastigoti di L.major per 6, 12, 18 e 24 ore. In una provetta da 1,5 millilitri, aggiungere 24 microlitri di terreno sierico ridotto e un microgrammo di plasmide a circuito sintetico.
In un'altra provetta da 1,5 millilitri, aggiungere 24 microlitri di terreno sierico ridotto e un microlitro di polietilenimmina o PEI. Mescolo bene pipettando almeno 10 volte e incubando a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire la miscela di PEI nella provetta da 1,5 millilitri contenente il DNA e mescolare bene.
Incubare la provetta per 10 minuti. Eliminare il terreno dai pozzetti sulla piastra inferiore del vetrino coprioggetto a 96 pozzetti e lavare le celle tre volte con PBS. Utilizzando una pipetta, aggiungere goccia a goccia la miscela DNA-PEI alle cellule e agitare delicatamente la piastra.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre ore. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di terreno di siero fresco ridotto alle cellule, agitare delicatamente la piastra e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, scartare il mezzo.
Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS, aggiungere alle cellule il terreno completo DMEM contenente geneticina e doxiciclina e incubare per 24 ore. La simulazione del circuito sintetico ha rivelato dinamiche oscillatorie sia nella SDHA che nel repressore della tetraciclina. L'introduzione del circuito sintetico in Escherichia coli DH5-alfa ha portato a colonie trasformate che mostrano resistenza alla kanamicina, indicativa di una trasformazione efficiente.
La trasfezione con il circuito sintetico e l'induzione con doxiciclina hanno aumentato significativamente l'espressione di GFP nelle cellule IMT nel tempo. Dopo la trasfezione e l'induzione della doxiciclina, è stata osservata una significativa riduzione del carico di parassiti intracellulari nei macrofagi infetti. I livelli di citochine di interleuchina 10 e interleuchina 12 erano più alti a sei ore dopo l'infezione, senza alcuna differenza significativa osservata dopo la trasfezione e l'induzione di circuiti sintetici.
Nel campione IMTI delle 24 ore è stato osservato un aumento significativo del fattore di necrosi tumorale alfa, dell'interferone gamma e del fattore di crescita trasformante beta, indicando l'upregulation delle citochine pro-infiammatorie.
