La nostra ricerca si concentra principalmente sulla connessione tra la riparazione del DNA e l'invecchiamento. In particolare, esaminiamo diversi disturbi della laminopatia e vogliamo capire come possono influire sulla riparazione del DNA. Abbiamo dimostrato che un disturbo della laminopatia associato all'invecchiamento precoce e a una breve durata della vita, noto come sindrome da progeria di Hutchinson-Gilford, è in realtà associato a un aumento del danno al DNA e a una riparazione imprecisa del DNA.
Il nostro laboratorio vorrebbe studiare l'effetto di potenziali terapie per i pazienti affetti da laminopatia per capire se questi approcci avranno anche un impatto positivo sulla riparazione e sul danno al DNA. Per iniziare, posizionare un vetrino di copertura in ciascun pozzetto di una piastra sterile a 6 pozzetti utilizzando una pinza. Aggiungere due millilitri di Dulbecco's Modified Eagle Medium, o DMEM, integrato a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
Aspirare il terreno dalle cellule HeLa coltivate nel pallone e lavare le cellule aggiungendo 15 millilitri di PBS. Agitare delicatamente il pallone per lavare le cellule, aspirare il PBS e aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA per rivestire le cellule. Posizionare il pallone rivestito di tripsina in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per due minuti per consentire il distacco delle cellule.
Quindi aggiungere otto millilitri di DMEM integrato al pallone contenente le cellule tripsinizzate e pipettare su e giù più volte per separare le cellule agglomeranti. Raccogliere la sospensione cellulare dal pallone in una provetta di polistirene da 15 millilitri. Dopo aver contato le cellule, aggiungere 500.000 cellule goccia a goccia direttamente su ciascuno dei vetrini di copertura nella piastra a 6 pozzetti.
Posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, per consentire alle cellule di crescere durante la notte. Per la fissazione cellulare, aspirare il terreno dai pozzetti della piastra a 6 pozzetti il giorno successivo. Aggiungere due millilitri di PBS a ciascun pozzetto per lavare le cellule e aspirare completamente tutto il PBS dai pozzetti.
Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di formaldeide al 4% in ciascun pozzetto per 10 minuti a temperatura ambiente e aspirare completamente la soluzione dai pozzetti. Quindi, aggiungere due millilitri di soluzione di permeabilizzazione a ciascun pozzetto. Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirarla completamente.
Lavare le cellule tre volte con due millilitri di PBS in ogni pozzetto. Aspirare completamente dopo ogni lavaggio. Una volta che tutto il PBS è stato aspirato dai pozzetti, aggiungere due millilitri di tampone diluente anticorpale, o ADB, a ciascun pozzetto per bloccare le cellule per la colorazione in immunofluorescenza.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti agitando delicatamente gli orbitali. Verso la fine del periodo di blocco. Preparare la diluizione dell'anticorpo primario mescolando il lume B1 e gli anticorpi del DNA a doppio filamento nell'ADB.
Al termine dell'incubazione, aspirare l'ADB dai pozzetti. Fissare con del nastro adesivo un pezzo di pellicola di paraffina su una superficie piana, assicurandosi che l'area sia sufficientemente grande da ospitare tutti i vetrini di copertura in lavorazione. Per ogni vetrino coprioggetti, pipettare 75 microlitri di diluizione dell'anticorpo primario sul film di paraffina evitando la formazione di bolle.
Usando una pinza, posizionare ciascuna cella del vetrino coprioggetti con il lato rivolto verso il basso sulla gocciolina di anticorpi. Coprire i vetrini coprioggetto di incubazione con il coperchio della piastra a 6 pozzetti e lasciare incubare i vetrini coprioggetti per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, utilizzando una pinza, rimuovere con cura i vetrini coprioggetti dalla pellicola di paraffina e riposizionarli nella piastra a 6 pozzetti con il lato della cella rivolto verso l'alto.
Lavare i vetrini agitandoli tre volte per cinque minuti con due millilitri di PBST. Durante il lavaggio finale, preparare la diluizione dell'anticorpo secondario. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare completamente PBST.
Aggiungere l'anticorpo secondario alla pellicola para e posizionare i vetrini coprioggetti sulla pellicola di paraffina, con la cellula rivolta verso il basso. Quindi posizionare una leggera copertura protettiva sopra i vetrini coprioggetti per proteggere le cellule dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Usando una pinza, rimuovere con cura i vetrini coprioggetto dal film di paraffina e riposizionarli nella piastra a 6 pozzetti, assicurandosi che il lato della cella sia rivolto verso l'alto, quindi disidratare i vetrini coprioggetti aggiungendo in sequenza due millilitri ciascuno di etanolo al 70% 90% e 100% ai pozzetti, lasciando riposare ciascuna soluzione per uno o due minuti prima della rimozione.
Usando una pinza, rimuovere i vetrini coprioggetti dai pozzetti e posizionarli su una salvietta priva di lanugine per asciugarli all'aria, al riparo dalla luce. Montare i vetrini coprioggetti con la cella rivolta verso il basso sui vetrini del microscopio utilizzando 20 microlitri di terreno di montaggio per vetrino. Il blebbing nucleare era più diffuso nelle cellule knockout HeLa ZMPST24 con circa il 50% dei nuclei che mostravano blebs, rispetto al 17% nelle cellule di controllo HeLa.
La perdita di DNA è stata osservata prevalentemente nelle cellule HeLa ZMPSTE24 knockout, mentre non è stata osservata alcuna perdita di DNA nelle cellule di controllo HeLa, la perdita di DNA si è verificata in alcune cellule knockout ZMPSTE24, anche in assenza di blebbing nucleare visibile.
