Questo studio è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health (GM071440 a CH e NS051630/MH076090/MH078972 a PJ).

1. Frammentazione del DNA genomico Frammento di DNA genomico mediante ultrasuoni ad una vasta dimensione desiderata adatto per il genoma a livello di piattaforma di sequenziamento. (Di solito sonicazione a ~ 300 bp.) Verificare la distribuzione dimensionale del DNA genomico frammentato 1% gel (Figura 1). 2. Estrazione del DNA Determinare le quantità di DNA di partenza in base alla abbondanza di 5-HMC nel DNA genomico. Dal 5-HMC livelli variano in modo significativo in diversi tipi di tessuto, quantità di DNA di partenza dipendono dalle 5-HMC livelli dei campioni. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per gli esempi. 3. β-GT reazione catalizzata (reazione di trasferimento del glucosio) <ol><li> Mescolare pipettando la miscela come descritto in Tabella 2 e incubare a 37 ° C in bagno di acqua per 1 ora. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, pulire la reazione con Kit Rimozione QIAquick Nucleotide, con 10 microgrammi di DNA percolonna. Eluire con 30 microlitri di acqua per colonna e combinare. </li></ol> 4. Biotinilazione Reazione (Click Chemistry) <ol><li> Aggiungere DBCO-SS-PEG3-Biotin coniugato soluzione di lavoro (1 mM) nella soluzione di DNA eluito (punto 3) ad una concentrazione finale di 150 pM (cioè 5 ml di soluzione di lavoro per 30 microlitri soluzione di DNA). </li><li> Mescolare pipettando e incubare a 37 ° C bagno di acqua per 2 ore. </li><li> Pulire la reazione con Kit Rimozione QIAquick Nucleotide. Il volume ideale di eluizione totale è di 100 ul. </li><li> Quantificare la quantità di DNA recuperato mediante spettrofotometro scala microlitro (ad es., NanoDrop). </li></ol> 5. Cattura di 5-HMC contenente DNA <ol><li> Lavare 50 pl di Dynabeads MyOne streptavidina C1 3 volte con 1 ml di 1X B &amp; W tampone secondo le istruzioni del produttore. Separare le perline con un supporto magnetico. </li><li> Aggiungere il volume uguale di 2X B &amp; W per il buffer di recupero D biotinilatoNA (100 ul) ai talloni lavate. </li><li> Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con lieve rotazione su un rotatore. </li><li> Separare le perline con un supporto magnetico e lavare le microsfere 3 volte con 1 ml di tampone 1X B &amp; W. </li><li> Eluire il DNA incubando le perle in 100 pl di preparati DTT 50 mM per 2 ore a temperatura ambiente con lieve rotazione su un rotatore. </li><li> Separare le perline con un supporto magnetico. Aspirare il eluente e carico su un Micro Bio-Spin 6 Colonna secondo le istruzioni fabbricazione per rimuovere il DTT. Il DNA bersaglio è nella soluzione ora. </li><li> Purificare il DNA eluito dal passaggio precedente Purification Kit Qiagen MinElute PCR e DNA eluire in 10 microlitri di tampone EB. Quantificare DNA utilizzando fluorimetro Qubit, NanoDrop o se la concentrazione è superiore a 20 ng / ul. Il DNA è pronto per la valle genome-wide preparazione sequenziamento biblioteca. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Se la qualità of DNA genomico è alta, i rendimenti tipici di recupero dopo il β-GT e le reazioni sono biotinilazione ~ 60-70%. Tuttavia, l&#39;efficienza di cattura variare significativamente diversi tipi di tessuto a seconda delle 5-HMC livelli dei campioni. Tipicamente, l&#39;efficienza di cattura per il DNA genomico è cervello ~ 4-9%, e in alcuni casi estremi, l&#39;efficienza può arrivare fino al 12%. Per le cellule ES, l&#39;efficienza di cattura medio è ~ 2-4%, in contrasto con ~ 0,5% per le cellule staminali neuronali. Il più basso rendimento visto finora è stato per il DNA genomico da cellule tumorali. Tutto DNA arricchito è pronto per i protocolli della libreria standard di nuova generazione di preparazione. Inoltre, il DNA catturato può anche essere usato come stampo per PCR in tempo reale per rilevare l&#39;arricchimento di alcuni frammenti rispetto al DNA di ingresso, se i primers correlati sono disponibili. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> Figura 1. Sonicati umani frammenti di DNA genomico in1% gel. 10 ug di DNA genomico isolato da cellule iPS umane in 120 pl di tampone TE 1X stata sonicata utilizzando un dispositivo di sonicazione (Covaris). Dopo sonicazione, 2 microlitri del DNA sonicato viene caricata su gel di agarosio 1% usando 100 bp di DNA marcatore per confrontare le dimensioni dei frammenti di DNA sonicato. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 2 microlitri </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Fino a 10 microgrammi di DNA genomico </td><td> _ Pl </td><td> Fino a 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-Glc (3 mM) </td><td> 0,67 pl </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 pM) </td><td> 1 ml </td><td> 2 pM </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 20 pl </td&gt; <td></td></tr></tbody></table> i) Per il DNA genomico del tessuto (alta 5-HMC contenuto&gt; 0,1%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Fino a 20 microgrammi di DNA genomico </td><td> _ Pl </td><td> Fino a 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 1,33 pl </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 pM) </td><td> 2 microlitri </td><td> 2 pM </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 40 ml </td><td></td></tr></tbody></table> ii) Per il DNA genomico di cellule staminali (mediana 5 HMC contenuti ~ 0,05%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Fino a 50 microgrammi di DNA genomico </td><td> _ Pl </td><td> Fino a 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 3,33 pl </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 pM) </td><td> 5 microlitri </td><td> 2 pM </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 100 pl </td><td></td></tr></tbody></table> iii) Per il DNA genomico delle cellule del cancro (basso 5-HMC contenuti ~ 0,01%) Tabella 1. Esempi di quantità di DNA di ingresso e di reazioni etichettatura utilizzando i campioni con diversi livelli di 5-HMC secondo il metodo chimico selettivo etichettatura. <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> 5-HMC livello </strong&gt; </td><td> DNA di partenza (mg) </td><td> Il recupero dopo l&#39;etichettatura (ingresso a sfere) (mg) </td><td> Recupero resa </td><td> Pull-down DNA (ng) </td><td> Pull-down cedere </td></tr><tr><td> Del mouse cervelletto adulto </td><td> 0,4% </td><td> 10 </td><td> 7,5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3,1% </td></tr><tr><td> Postnatale giorno 7 del mouse cervelletto </td><td> 0,1% </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1,6% </td></tr><tr><td> Topo ES cellule E14 </td><td> 0,05% </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0,8% </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Risultati rappresentativi di tessuti cerebrali di topo e cellule ES.

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	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , 245-254 (2003).</li><li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion,+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification.">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain.">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li><li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li><li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li><li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine.">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li><li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241 (2011).</li><li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes.">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li><li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development.">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing.">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888 (2010).</li><li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine.">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li><li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells.">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li><li>Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine:+a+new+kid+on+the+epigenetic+block.">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).</li><li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA.">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).</li><li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+recombinant+&#946;-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes.">Biochemical characterization of recombinant &#946;-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li><li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts.">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li><li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates.">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367 (2010).</li><li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mbd3/NURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells.">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells.">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).</li><li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging.">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) è un regalo recentemente identificato modificazione epigenetica in quantità notevoli in alcuni tipi di cellule di mammifero. Il metodo qui presentato è per la determinazione del genoma distribuzione a livello di 5-HMC. Usiamo batteriofago T4 β-glucosil trasferire una porzione multistrato glucosio contenente un gruppo azide sul gruppo ossidrile di 5-HMC. Il gruppo azide può essere chimicamente modificato con biotina per il rilevamento, l&#39;arricchimento di affinità, e sequenziament...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Catalogare # </td><td> Commento </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio 5M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5M pH8.0 Etilendiammintetraacetato (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma base (Tris) pH7.5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio (MgCl2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-biotina coniugato </td><td> Fare clic su Strumenti Chimica </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-Dithiothreitol, ultrapura (DTT) superpuro </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick Kit Rimozione Nucleotide </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Colonna </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glucosio </td><td> Motif attivo </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzima </td></tr><tr><td> β-glucosil (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Sonicazione dispositivo </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Desktop centrifuga </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel apparecchi in esecuzione </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Separazione supporto magnetico </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 fluorimetro </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente di installazione 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM MgCl2) 2 X Legatura e lavaggio (B &amp; W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,02% Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

selective capture of 5-hydroxymethylcytosine from genomic dna

5-metilcitosina (5-mC) costituisce ~ 2-8% dei cytosines totali in DNA genomico umano e influisce un&#39;ampia gamma di funzioni biologiche, tra l&#39;espressione genica, il mantenimento dell&#39;integrità genomica, imprinting parentale, inattivazione del cromosoma X, regolazione sviluppo, invecchiamento e cancro 1. Recentemente, la presenza di un ossidato 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), è stato scoperto in cellule di mammifero, in particolare nel staminali embrionali (ES) cellule e cellule neuronali 2-4. 5-HMC è generato per ossidazione di 5-mC catalizzata da TET famiglia ferro (II) / α-chetoglutarato-dipendente diossigenasi 2, 3. 5-HMC si propone di essere coinvolto nel mantenimento di staminali embrionali (MES) delle cellule, emopoiesi normale e le neoplasie, e zigote sviluppo 2, 5-10. Per capire meglio la funzione di 5-HMC, un sistema di sequenziamento affidabile e semplice è essenziale. Sequenziamento bisolfito tradizionale non è possibile distinguere 5-HMC da 5-MC 11 </sup&gt;. Per svelare la biologia di 5-HMC, abbiamo sviluppato un approccio chimico altamente efficiente e selettivo di etichettare e catturare 5-HMC, approfittando di un enzima batteriofago che aggiunge una frazione di glucosio al 5-HMC specifico 12. Qui si descrive una semplice procedura in due fasi per l&#39;etichettatura chimica selettiva di 5-HMC. Nella prima fase di etichettatura, 5-HMC nel DNA genomico viene etichettato con un 6-catalizzata azide-glucosio da β-GT, un glucosiltransferasi dal batteriofago T4, in modo che trasferisce il 6-azide-glucosio al 5-HMC dal modificato cofattore, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Nella seconda fase, biotinilazione, un linker biotina disolfuro è attaccato al gruppo azide dalla chimica click. Entrambe le fasi sono altamente specifici ed efficienti, portando a completare etichettatura indipendentemente l&#39;abbondanza di 5-HMC in regioni genomiche e dando fondo estremamente bassa. Biotinilazione seguito di 5-HMC, i 5-HMC contenenti frammenti di DNA vengono selettivamente catturatiutilizzando perline streptavidina in una densità modo indipendente. La risultante 5-HMC arricchiti frammenti di DNA potrebbe essere utilizzato per analisi a valle, sequenziamento di prossima generazione. La nostra etichettatura selettiva e il protocollo di acquisizione conferisce elevata sensibilità, applicabile a qualsiasi fonte di DNA genomico con variabili / 5-HMC diverse abbondanze. Anche se lo scopo principale di questo protocollo è la sua applicazione a valle (ad es., Sequenziamento di prossima generazione per tracciare il 5-HMC distribuzione nel genoma), è compatibile con singola molecola, in tempo reale SMRT (DNA) sequenziamento, che è in grado di erogare singola base sequenziamento risoluzione del 5-HMC.

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Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l&#39;arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l&#39;arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

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Biology

11.9K Views.  Emory University School of Medicine. Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l'arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l'arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.