Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

I seguenti protocolli descrivono la procedura dettagliata per C. pelle elegans ferendo e per saggiare le risposte ferite. 1. Ago Ferimento 3,4 <ol><li> Crescere vermi unstarved sani sullo standard NGM (terreno di crescita nematode) piatti con E. batteri coli OP50 come cibo, mantenute in un incubatore a 20 °. NOTA: I metodi per piastre di agar NGM e la coltivazione di routine di C. elegans può essere trovato alla www.wormbook.org 6. </li><li> Scegli 25 L4 vermi stadio ad un appena seminato piatto 1 giorno prima ferendo e cultura a 20 ° CO / N. </li><li> Prima di ferimento, tirare aghi da capillari con un estrattore ago. Gli aghi utilizzati in ferimento sono identici a quelli utilizzati per microiniezione di C. elegans. </li><li> Assicurarsi che tutti i vermi sono al giovane stadio adulto. Posizionare la piastra di vermi su ghiaccio per circa 30 min. Raffreddamento induce gli animali ad essere lenta, facilitando ago ferimento. <br /&gt; NOTA: Entro 5 minuti di allontanamento dal ghiaccio, i vermi inizierà a muoversi normalmente. E &#39;possibile, ma difficile da ferire vermi in movimento. Con l&#39;esperienza, 5 min è abbastanza tempo per ferire 25 vermi. Immobilizzarlo con farmaci come levamisolo (utilizzati in ferimento laser, vedi sotto), anche se gli animali ci vorrà più tempo per recuperare. </li><li> Rimuovere la piastra di agar dal ghiaccio di uno stereomicroscopio dissezione. Utilizzando un pick verme, spostare 25 vermi nel centro della piastra di agar. </li><li> Posizionare l&#39;ago in un puntale 100 microlitri di tenere più facilmente l&#39;ago. Perforare la parte anteriore o posteriore del corpo della vite senza fine con l&#39;ago, evitando gonade. In generale, tentare di ferire tra posteriore e anteriore della faringe gonadi, o tra gonade posteriore e il retto. Riutilizzo aghi molte volte, fino a quando non si rompono. NOTA: Assicurarsi che le ferite sono brevi, punture dolci che forare la cuticola e la pelle, penetrando ~ 5-10 micron nell&#39;animale. L&#39;ago deve entrare nel animal di circa un angolo retto rispetto alla pelle. Le ferite non devono causare danni evidenti agli organi interni, o rottura immediata del corpo. Osservare una piccola quantità di citoplasma trasudano per alcuni secondi dopo la ferita; Tuttavia, se i contenuti cellulari fuoriuscire per un periodo prolungato gli animali non sopravviverà. Per l&#39;imaging ottimale, ferita la syncytium laterale epidermico (hyp7) o la cucitura laterale. NOTA: Questo procedimento comprende l&#39;uso di un ago di vetro. </li><li> Consentire worm di recuperare a RT poi cultura a 20 ° C. Giudicare il successo di ago ferita da un certo numero di saggi descritti di seguito. Superiore al 95% del tipo di animali selvatici a sopravvivere 24 ore dopo l&#39;ago ferito nella fase adulta giovane. L&#39;effetto di ferire in larve o anziani non è ancora stato ampiamente analizzato. </li></ol> 2. Laser Ferimento 3 Utilizzare irraggiamento laser a femtosecondi (800 nm) per eseguire ferite più precise. <ol><li> Preparare agar pannunci su un vetrino con il fuso 2% agar 7. Assicurarsi che le pastiglie sono simili ai pad agar utilizzati per l&#39;imaging in tempo reale di C. elegans. </li><li> Trasferire 10 giovani vermi adulti sul pad agarosio con vite senza fine ritiro, e aggiungere una goccia 2 ml di soluzione di 12 Levamisolo mm. Coprire gli animali e il liquido con un vetrino. Attendere 1-2 minuti per il worm per paralizzare. </li><li> Posizionare il vetrino su un microscopio confocale spinning disk. Spostare lo stadio per trovare i vermi e concentrarsi sulle anteriore o posteriore sinciziale epidermide laterali con un obiettivo 100X (NA 1,4-1,46). </li><li> Impostare la potenza del laser a femtosecondi a 140 mW (misurata prima l&#39;obiettivo). Utilizzare il laser a femtosecondi ad una frequenza di ripetizione di 80 MHz. NOTA: due impulsi di 200 msec ciascuno (separati da 20 msec) sono sufficienti per il ferimento nelle nostre mani. </li><li> Concentrarsi sulla superficie apicale della cellula epidermica e ferita l&#39;epidermide. Osservare interruzione locale del citoplasma (bubbling), o sbiancamento locale of qualsiasi marcatore fluorescente usato. NOTA: Seguire le opportune procedure di sicurezza del laser quando si utilizza il laser a femtosecondi. Linea o punto di scansione con laser a femtosecondi, come quelli di due microscopi fotoni devono fornire potenza sufficiente per ferimento laser. NOTA: Anche se non abbiamo esperienza diretta di utilizzo di altri laser, in linea di principio ferimento dovrebbe essere possibile mediante laser UV convenzionali (come usato in C. elegans ablazioni cellulari). Facoltativamente, utilizzare un FRAP modulo (FRAP) sul disco rotante confocale per ferire l&#39;epidermide (N. Pujol, comunicazione personale). </li></ol> 3. Visualizzazione di Epidermal Ca 2+ Risposte ad Ferimento <ol><li> Utilizzare transgenico C. elegans ceppi che esprimono Ca 2+ sensori (come quelli della serie GCaMP) nell&#39;epidermide, sotto il controllo del promotore specifico epidermica adulto col-19 (Figura 1A; transgeni sono elencati <strong&gt; Tabella 1). Utilizzare un transgene che esprime una proteina fluorescente rossa come tdTomato come controllo interno per il livello di espressione del transgene. NOTA: Abbiamo usato tdTomato come controllo interno per l&#39;espressione del transgene come epidermica tdTomato fluorescenza è relativamente stabile e non interferisce con le immagini GCaMP. </li><li> Sia ago e laser ferendone grilletto Ca 2+ elevazione nell&#39;epidermide. Tuttavia, poiché l&#39;ago ferimento non può essere facilmente eseguita su un disco confocale filatura, ferimento laser è preferibile per l&#39;analisi quantitativa del Ca 2+ risposta (Figura 1). </li><li> Acquisire le immagini lasso di tempo in modalità di acquisizione multidimensionale (intervallo di 2 secondi con 114 msec esposizione laser eccitazione) utilizzando un confocale spinning disk con obiettivo 100X (NA 1,4-1,46) e appositi set di filtri (filtri GFP lavorerà per GCaMP3). NOTA: Acquisire immagini time-lapse ogni 30 sec per circa 2 ore per esaminare il Ca 2+ respOnse a ferendone più di un corso di tempo più lungo. </li><li> Utilizzando il software di analisi di immagine misurare la fluorescenza media GCaMP in dieci regioni equivalenti di interesse (ROI), cinque delle quali sono centrate sul citoplasma delle cellule epidermiche e cinque in background. </li><li> Ottenere fluorescenza basale (F 0) calcolando la media di fluorescenza in 5 ROI nell&#39;epidermide poi sottraendo la media di 5 ROI in background prima della ferita. Esprimere la variazione di fluorescenza Af come il rapporto di variazione rispetto alla linea di base [(F t -F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualizzazione di Dynamics F-actina dopo aver ferito <ol><li> NOTA: In risposta a spillo ferite, osservare un anello di actina nel sito della ferita che chiude progressivamente intorno alla ferita. Questa sezione protocollo saggi avvolti chiusura misurando il diametro dell&#39;anello actina. </li><li> Generare vermi transgenici che esprimono un indicatore F-actina come il moesina actina dominio Drosophila legame fusoGFP, espresse sotto il controllo di un promotore specifico epidermica come col-19 (Figura 2A) (transgene juIs352). NOTA: Abbiamo ottenuto risultati simili utilizzando altre vincolante marcatori dominio come Lifeact o F-tractin (risultati non pubblicati) actina. </li><li> Eseguire ago ferendo on P col-19- GFP-moesina vermi transgenici. Dopo ago ferimento, osservare un anello di GFP-moesin intorno al sito della ferita da ~ 5 min. L&#39;anello actina diventa più piccolo diametro e alla fine chiude 2-3 ore dopo il ferimento in animali wild type (Figura 2a). </li><li> Preparare un tampone agar 2% su un vetrino e trasferire 10 vermi sul pad in 2 soluzione ul 12 Levamisolo mm. Immagine gli anelli GFP-moesina 1 ora dopo il ferimento usando la microscopia confocale convenzionali. NOTA: Utilizzare la microscopia confocale di acquisire z-stack (13 x 0,5 micron) di anelli di actina 1 ora dopo il ferimento. </li><li> Misurare il diametro degli anelli actina dopo il ferimento. Per quantificare epidermica GFP-moesin, prima fare una proiezione di massima intensità del z-stack e quindi disegnare 4 scansioni di linea (a 45 ° tra loro) oltre l&#39;anello GFP-moesin. Diametro dell&#39;anello è definito come il picco medio della distanza di picco dei quattro scansioni linea (Figura 2B). Per gli anelli che sono già chiuse, il diametro è definito come 0 micron. NOTA: F-actina anelli sono convenientemente misurate 1 ora dopo il ferimento in quanto questo è a circa metà strada attraverso il processo di chiusura della ferita nel tipo selvatico. Anelli F-actina possono essere misurate in più punti di tempo per ricavare un corso a tempo di chiusura della ferita. Tempo lapse film di chiusura della ferita possono essere acquisiti tramite worm levamisolo-immobilizzato e spinning disk microscopia confocale. </li></ol> 5. Assay induzione di epidermico antimicrobici Peptidi NOTA: Ferimento innesca anche le risposte immunitarie innate in C. pelle elegans. Trascrizione di geni che codificano peptidi antimicrobici (AMP) è induced nell&#39;epidermide. NLP-29 (proteina neuropeptide-like) AMP è fortemente indotta da ferendo 4. Per saggiare quanto l&#39;epidermide controlla l&#39;espressione AMP dopo ferimento, usare i giornalisti transgenici o real-time PCR per rilevare i singoli livelli di trascrizione AMP. <ol><li> Transgenici test giornalista per la risposta immunitaria innata ferendo 4. </li><li> Eseguire ago ferimento (come nel protocollo 1) su animali adulti che esprimono il reporter transgenico frIs7, che contiene P nlp-29- GFP e P col-12- DsRed come controllo interno. Osservare gli animali adulti illesi rosso scuro o arancione in un filtro passaggio lungo GFP. NOTA: Ferita wild-type vermi indurre P nlp-29-GFP espressione, ma non influirà P col-12 -dsRed, con conseguente vermi che appaiono di colore arancione, giallo o verde sotto GFP passaggio lungo l&#39;illuminazione. La perdita della funzione dei geni nel pathway p38 MAPK, come PMK-1 o NSY-1 sarà bloccare nlp-29-GFPinduzione dopo ferendo 4. GFP P nlp-29- è espressa ad alti livelli in stadi larvali </li><li> Effettuare test di induzione AMP in giovani animali adulti. Assicurarsi che gli animali di controllo illesi hanno bassi livelli di GFP. NOTA: P nlp-29- espressione GFP è anche indotta da stress osmotico 8, e può essere sensibile ad altri stress ambientali. </li><li> 6 ore dopo il ferimento, segnare il numero di worm che hanno P nlp-29-GFP induzione (Figura 3) 9 con una fluorescenza dissezione portata con GFP filtro passa lungo. NOTA: A 1 ora post-ferimento P nlp-29- GFP è visibilmente indotto, raggiungendo un picco di circa 6 ore post-ferimento e poi rimanendo elevata fino a 24 ore dopo il ferimento. Quantificare l&#39;espressione del 4,9 punteggio visivo. In alternativa, quantificare i livelli di espressione con una fluorescenza attivato verme sorter 4. Per il sorter verme, almeno 50 animali hanno bisogno di essere feriti. </li><li> Real-time PCR per quantitating livelli di trascrizione dei singoli geni AMP. Livelli di trascrizione del dosaggio di diversi geni: nlp-29, nlp-30, cnc-1, e cnc-5. </li><li> Eseguire ago ferendo on wild-type o vermi mutanti (vedi protocollo 1) </li><li> Raccogliere 50 vermi feriti e 50 illesi vermi nei momenti desiderati (ad esempio, 3, 6, 24 ore) post-ferimento. </li><li> Estratto di RNA utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa per ottenere totale cDNA 20 microlitri utilizzando un kit trascrittasi inversa commerciale. </li><li> Per RT-PCR, utilizzare 0,2 microlitri cDNA (1/40) di ciascun campione in combinazione con un supermix verde con fluoresceina e 0,2 mM primers. Per confrontare la qualità RNA, utilizzare ama-1 o SNB-1 RT-PCR come riferimento; confrontare il livello di espressione relativa AMP normalizzando di controllo interno (AMA-1 o SNB-1), o confrontare induzione volte post-ferimento (induzione AMP in worms feriti / worm illesi) di normaalizing di controllo interno. NOTA: cnc-1 e cnc-5 sono caenacin famiglia peptidi antimicrobici la cui trascrizione è attivata da ferendone 10. In genere, l&#39;ago ferimento induce l&#39;espressione (~ 500 volte per cnc-1) per un corso tempo di 4 ore 10. Primers utilizzati nel lavoro pubblicato sono elencati nella Tabella 2. </li></ol> 6. Tenore di sopravvivenza dopo aver ferito <ol><li> NOTA: Ferimento attiva almeno due vie di segnalazione indipendenti nell&#39;epidermide: Ca 2+ ferita dipendente riparazione percorso e l&#39;innata percorso risposta immunitaria. Entrambi i percorsi sono necessari per la piena sopravvivenza del ferimento sterile. Per verificare se un mutante o un trattamento RNAi colpisce la guarigione della ferita, misurare la sopravvivenza a 24-48 ore dopo il ferimento. Facoltativamente, utilizzare test di durata della vita convenzionale per determinare l&#39;effetto di ferire sulla longevità 4,9. </li><li> Eseguire ago ferendo il giovane adulto (L4 + 24 ore) vermi (50 vermi, ripetere sevevolte RAL) seguenti sopra protocollo 1. Mantenere un numero equivalente di vermi illesi come controlli. </li><li> Controllare la sopravvivenza ogni 24 ore (trasferimento vermi feriti ad una nuova piastra di agar ogni 24 ore). Osservare ~ 50% di sopravvivenza 24 ore dopo il ferimento in mutanti che sono difettosi nella riparazione delle ferite, come GTL-2 o tir-1, quando normalizzata per animali di controllo illesi. La morte è definito come una mancanza di risposta locomotoria toccare con vite senza fine ritiro. </li></ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

I metodi qui presentati per ago e ferimento laser offrono approcci complementari di valutazione della capacità dell&#39;epitelio epidermica per riparare i danni. Ferimento laser è relativamente localizzato e (a seconda della configurazione laser) può essere limitato l&#39;epidermide, mentre ferimento ago sconvolge l&#39;epidermide, cuticola, e probabilmente membrane basali interni. Ago ferimento può assomigliare più accuratamente le ferite inflitte da agenti patogeni o danni meccanici in ambiente naturale. Come reg...

Pelle ferita meccanismi di guarigione sono di interesse biologico di base e rilevanti per la salute umana. La guarigione delle ferite nei vertebrati e mammiferi comprende una complessa serie di risposte coordinate di diversi tessuti e di segnalazione 1. Molti semplici organismi modello genetico sono anche in grado di guarire le ferite della pelle 2. È quindi interessante analizzare modelli geneticamente trattabili di riparazione delle ferite della pelle. Noi e altri abbiamo iniziato a utilizzare Caenorhabditis elegans come nuovo modello per la pelle ferita guarigione 3,4. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di consentire una più ampia serie di ricercatori da utilizzare C. elegans come strumento per indagare i meccanismi molecolari e cellulari della epidermica guarigione delle ferite. Il C. pelle elegans comprende l&#39;epidermide (noto anche come ipoderma) e la cuticola extracellulare 5. L&#39;epidermide adulto è formato da un piccolo numero di sincizi multinucleate, di cui il più grande è il sincizio known come hyp7. L&#39;epidermide è un epitelio semplice che secerne cuticola sulla sua superficie apicale. La pelle può difendere attivamente contro gli agenti patogeni-pelle penetrante e riparare piccole ferite 4. Riparazione della ferita del C. pelle elegans è robusto, come quasi tutti i tipi di animali selvatici sopravvivono possono sopravvivere piccole punture provocate da aghi, o danni alla pelle locale causati da irraggiamento laser. C. elegans pelle ferimento innesca una serie di reazioni, tra cui una risposta epidermica innata immunitaria, la chiusura della ferita, e la formazione di cicatrici 4. L&#39;epidermide adulti è post-mitotico, e la guarigione delle ferite comporta risposte cellulari locali in contrasto con la proliferazione epidermica o la migrazione delle cellule. Abbiamo dimostrato che il ferimento pelle innesca un grande e costante aumento in epidermica Ca 2+, che richiede il canale di membrana TRPM GTL-2 e interni di Ca 2+ negozi 3. Il segnale è richiesto epidermica Ca 2+ per la formazione e la chiusura di anelli F-actina al wound sito. Ferimento induce anche le risposte immunitarie innate che attivano la trascrizione di AMP, come la PNL-29. La trascrizione ferimento indotto di AMP è dipendente da un TIR-1 / PMK-1 p38 MAP chinasi cascade agire autonomamente nell&#39;epidermide 4. Difetti in entrambi la segnalazione via Ca 2+ o nella risposta immunitaria innata porterà alla sopravvivenza inferiore post-ferimento. La struttura relativamente semplice del C. elegans epidermide, la sua trattabilità genetica e vantaggi per imaging in vivo ne fanno un sistema eccellente per studiare i molteplici aspetti di riparazione delle ferite. Qui vi presentiamo i protocolli per i due metodi comuni di ferimento: ferimento ago e ferimento laser. Ferimento dell&#39;ago non richiede attrezzature specializzate (diverso estrattore ago), e con esperienza può essere eseguita su centinaia di vermi al giorno. Ferimento ago viene eseguita su animali in crescita su piastre di agar. Al contrario, ferimento laser viene eseguita su anesanimali thetized montati su agar pad sotto un coprioggetto, ed è adatto per l&#39;imaging dal vivo delle risposte cellulari al danno.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Name</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:227px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:227px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:227px;">CA3510-8</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Plastic Petri plate</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">T3308</td>
			<td style="width:227px;">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Levamisole</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">L9756</td>
			<td style="width:227px;">12 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;"><a name="RANGE!A5">Borosilicate Glass Capillary&#160;</a></td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:227px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Needle puller</td>
			<td style="width:227px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:227px;">P-2000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Worm pick (Platinum wire)</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">PT-9010</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:227px;">M9 solution</td>
			<td style="width:227px;">Home-made</td>
			<td colspan="2" style="width:453px;">3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Trizol</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:227px;">15596026</td>
			<td style="width:227px;">Use 500 ml for 50 worms</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">iQ SYBR Green</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:227px;">1708882</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">SuperScript III</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:227px;">18080-051</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">PCR machine</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">C1000/CFX96</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">96-well PCR tubes</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">MLL9601</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:227px;">Metamorph</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

Il C. elegans epidermide e cuticola formano uno strato di pelle ma sofisticato semplice che può riparare i danni localizzati derivanti da ferire. Studi di risposte ferita e riparazione di questo modello hanno illuminato la nostra comprensione del citoscheletro e risposte genomiche per danni ai tessuti. I due metodi più comunemente usati per la ferita C. elegans pelle adulta sono punture con aghi microiniezione e irraggiamento laser locale. Ago ferendo localmente interrompe la cuticola, epidermide, e matrice extracellulare associati, e può anche danneggiare i tessuti interni. Risultati irradiazione laser a danni più localizzato. Ferimento innesca una serie di reazioni prontamente analizzati, tra cui elevata epidermica Ca 2+ (secondi minuti), la formazione e la chiusura di un anello-actina contenenti presso il sito della ferita (1-2 ore), elevata la trascrizione di geni peptidi antimicrobici (2-24 hr), e formazione di cicatrici. In sostanza tutti gli animali adulti wild type sopravvivono ferimento, dovecome mutanti difettose nella riparazione delle ferite o altre risposte mostrano ridotta sopravvivenza. Vengono presentati i protocolli dettagliati per ago e il ferimento laser, e saggi per la quantificazione e la visualizzazione delle risposte della ferita e dei processi di riparazione (dinamica Ca, dinamiche actina, induzione peptide antimicrobico, e la sopravvivenza).

Laser o ago ferimento attiveranno elevazione rapida e sostenuta in epidermiche livelli di Ca, come visualizzato con sensori Ca quali GCaMPs (Figura 1). L&#39;elevazione Ca avviene in pochi secondi, e rimane elevata per decine di minuti. Needle ferendo riproducibile provoca la formazione di anelli F-actina in siti ferita (Figura 2); queste appaiono in pochi minuti, e gradualmente vicino oltre 1-2 ore dopo il ferimento. Anelli actina sono meno spesso si formano dopo più preciso ferimento...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.2K Views.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Video: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmi per la caratterizzazione farmacologica di C. elegans Mutanti trasmissione sinaptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Ricerca

Biologia

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Saggi Neurocircuit per Sequestri in mutanti di Epilessia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...