Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Borse Salute EY0081 e 5T32UY07145 e dalla Fondazione Eye Cavalieri Templari. Jason Rihel è un Squibb Bristol-Fellow del Life Sciences Research Foundation.

Questo protocollo delinea i passaggi per eseguire il Visual-Motor risposta delle larve di zebrafish per incrementi di luce e decrementi nel vostro laboratorio. Zebrafish è un sistema di grande modello per gli studi comportamentali. Sono facili da mantenere, non hanno dimensioni frizione grande, e si sviluppano rapidamente. Per esempio, gli occhi delle larve di zebrafish sono sensibili alla luce da 3 ° giorno di sviluppo e in quel momento che mostrano una risposte di allarme. Parte 1: Placcatura singolo pesce in un piatto da 96 pozzetti <ol><li> Crescono le larve WT sotto un ciclo di buio / luce a 28 ° C fino almeno 4 giorni dopo la fecondazione (DPF). La nostra tipica luce: buio ciclo è di 14 ore di luci ON partire alle 9:00, e 10 ore di luci spente, dalle ore 11:00 PM. Per ottenere i migliori risultati comportamentali, evitare il sovraffollamento, noi di solito tenere non più di 50 larve in un piatto unico di Petri. </li><li> Dopo 4 dpf, il pesce zebra sono pronti per essere trasferiti in una piastra da 96 pozzetti. Per dare più la stanza di nuoto larve, si utilizzano in genere una piastra a 96 pozzetti con un grande e dimensioni di 650 microlitri, tuttavia, standard piastre a 96 pozzetti funzionano bene. Utilizzando una pipetta di plastica trasferimento, delicatamente trasferire una larva ogni bene. </li><li> Dopo aver trasferito i pesci nei pozzetti, compila ogni pozzetto con acqua abbastanza pesce in modo tale che la superficie dell&#39;acqua è quasi a filo con la parte superiore dei pozzetti. Sia eccessivo riempimento o underfilling il bene può causare problemi ottici per la macchina fotografica di registrazione. Inoltre, fare attenzione a non introdurre bolle nei pozzetti. </li></ol> Parte 2: Indagine degli apparati di registrazione Per questa parte del protocollo, si rimanda al film per identificare i componenti e per familiarizzare con il nostro set up degli apparecchi di registrazione. <ol><li> All&#39;interno della camera di registrazione è un luogo ben definito per posizionare la piastra a 96 pozzetti. </li><li> La telecamera è posizionata nella parte posteriore e si concentra sul piatto usando specchi fuori dalla scatola. L&#39;angolo di questi specchi può essere regolata girando le viti che fissano gli specchi in posizione. </li><li> La camera di registrazione è illuminata dal basso da led a infrarossi. Questo permette alla telecamera di vedere i pesci anche al buio. Le larve non in grado di rilevare la luce a infrarossi, per cui questa illuminazione costante IR non influenza l&#39;esperimento. LED bianchi illuminare anche la camera di registrazione dal basso. Sono controllati singolarmente dalle luci a infrarossi. Illuminando la camera con luce bianca dall&#39;alto o dai lati è certamente possibile, ma in quei casi, bisogna fare attenzione per evitare forti riflessi sulla superficie dell&#39;acqua che possono interferire con la fotocamera. </li><li> Per gli esperimenti che durano più di un paio d&#39;ore, riempire la camera con acqua corrente per aiutare a mantenere una temperatura costante per tutta la durata sperimentale. Un modo per ottenere un flusso costante di acqua per pompare l&#39;acqua da un serbatoio con una pompa piccolo acquario che viene riscaldato a 28 ° con un riscaldatore tipico acquario subacqueo. </li><li> Per ridurre al minimo le vibrazioni randagi dalla sala, l&#39;unità intera registrazione dovrebbe sedersi su un tavolo equilibrio pesante. </li></ol> Parte 3: Allineamento della piastra a 96 pozzetti con la rete del computer del video-tracking Software <ol><li> Posizionare la piastra a 96 pozzetti contenenti il ​​pesce nella camera di registrazione. </li><li> Quando si utilizza un bagno d&#39;acqua, lentamente la piastra in acqua, dando il livello dell&#39;acqua la possibilità di regolare senza spargere sulla piastra. In alternativa, interrompono il flusso di acqua, aggiungere il piatto, e poi riprendere il flusso. Inoltre, assicurarsi di utilizzare una molla o un elastico per tenere la piastra a 96 pozzetti in posizione. </li><li> Nel software Videotrack Punto di vista, verificare che tutte le larve del vostro esperimento sono visibili sullo schermo del computer. Utilizzando i controlli del software, allineare la griglia del video-tracking software con i pozzi di piatto in modo che ogni pesce è all&#39;interno di un quadrato della griglia. Il computer di tracciamento sarà il calcolo del movimento separatamente per ciascuna di queste caselle, quindi se si disallineare la griglia del computer alcuni tra i movimenti dei pesci può essere perso. O anche peggio: due pesci adiacenti occupare la stessa area e di essere contato come un pesce. Questo passaggio è molto importante per tutte le registrazioni. </li><li> Dopo l&#39;allineamento, programma i tempi di quando le luci si dovrebbe andare on e off. Noi di solito consentono 3 ore di adattamento chiaro o scuro nella casella sia per ottenere un livello di attività di base, ma anche per dare le larve l&#39;opportunità di calmarsi dopo il pipettaggio e maneggevolezza. Dopo la linea di base, che poi si alternano con 30 minuti di luci ON seguito da 30 minuti di luci spente, e ripetere più volte. </li><li> Quindi, chiudere la porta della camera di registrazione e avviare la registrazione. </li><li> In pratica, noi registriamo l&#39;attività di ogni pesce per secondo, ma il software Punto di vista, infatti, registra i dati fotogramma per fotogramma (fare riferimento al filmper una dimostrazione della raccolta dei dati). Definizione del valore soglia minima per la modifica dei pixel per fotogramma dipenderà un po &#39;sulla fotocamera e la configurazione particolare della luce. Per il nostro sistema, si utilizzano in genere una soglia di 4 pixel, cioè se meno di 4 pixel stanno cambiando, si è ritenuto di fondo. Se più di 4 pixel in movimento, significa che il pesce è in movimento. Noi empiricamente determinato che questo taglio di rilevare quasi tutte le nuotare larvale e movimenti turno. </li><li> Anche se le caselle di registrazione isolare le larve abbastanza bene, spegnere la luce nella stanza e prendersi cura di ridurre al minimo le interruzioni con il rumore meccanico, come la chiusura e aprire le porte della stanza, una festa da ballo, o di fare la vostra routine di esercizi. </li></ol> Parte 4: Analisi dei dati <ol><li> Dopo l&#39;esperimento è stato completato, il trasferimento dei dati raccolti in un foglio excel o nella vostra suite di analisi preferito. </li><li> Il foglio allegato excel è un esempio di ciò che i dati personali possono essere: contiene il tempo in secondi dall&#39;inizio della sperimentazione e l&#39;attività di ogni larva per secondi per tutti i pesci durante l&#39;intero esperimento (vedi supplementare dei dati Esempio di file in la sezione File di questa pagina). </li><li> La figura 1 mostra un esempio di attività di una sola larva. Figura 2 è una traccia rappresentativo della media di 40 larve di zebrafish WT. La media di ON e OFF sono le risposte e di primo piano. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Figura 1" width="569" height="398" /> Figura 1: Attività di un singolo pesce L&#39;attività di un singolo pesce WT a 5 dpf in risposta a periodi alternati di 30 minuti di luce ON e OFF.. Le risposte ON sono indicati da frecce nere e le risposte OFF con frecce rosse. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Figura 2" width="577" height="387" /> Figura 2: l&#39;attività media di 40 pesci L&#39;attività media di 40 pesci WT a 5 dpf in risposta a periodi alternati di 30 minuti di luce ON e OFF.. La media di ON (frecce nere) e OFF (frecce rosse) sono le risposte e di primo piano. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Figura 3 è un profilo schematico del contorno sperimentali utilizzati in tutti i nostri esperimenti. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Figura 3" width="530" height="479" /> Figura 3. Disegno sperimentale di Visual risposta motoria (VMR) test.) Pesci singoli sono posti in una piastra a 96 pozzetti in una camera di registrazione. L&#39;attività di ogni pesce è misurata al secondo. B) I pesci sono concesso un periodo di adattamento al buio o luce per risolverle e per ottenere un livello di attività di base. Periodi di 30 minuti su luci e le luci spente vengono introdotti consecutivamente per un totale di 3 ore. Questo schema è stato adattato da Prober et al., 2006. Qual è il Visual-Motor grafici di risposta simile? Abbiamo misurato le risposte ON e OFF di pesce WT alla luce incrementi e decrementi. Per confermare che queste risposte sono state dipende dalla funzionalità degli occhi, abbiamo misurato l&#39;attività dei mutanti chk, che non sviluppano alcun occhi. La Figura 4 mostra l&#39;attività di medi ottenuti da animali WT così come i mutanti chk. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Figura 4" width="489" height="212" /> Figura 4: pesce WT hanno chiare ON e OFF risposte che sono mediati dagli occhi laterali Il comportamento locomotorio di larve di pesce zebra a 5 dpf in risposta a 30 minuti di luce ON e OFF 30 minuti di luce è registrato al secondo.. Ogni traccia rappresenta una media di 480 risposte da 120 singoli WT (traccia blu) o chk larve mutanti (arancione traccia) ha registrato oltre 3 esperimenti. I mutanti chk non aumentare significativamente la loro attività sia a incrementi o decrementi luce e hanno un basso livello basale di attività. Questo dato è stato adattato da Emran et al., 2007. Visual-Motor Risposte dal pesce NRC mutante. Il mutante NRC è stato pensato per essere completamente cieco in base al test okr. Nel mutante NST, i terminali dei fotorecettori non fanno correttamente e l&#39;On percorso visivo è gravemente compromessa 1. Le registrazioni delle cellule gangliari della retina di questi pesci mutanti ha rivelato che essi presentano prevalentemente OFF-tipo le risposte delle cellule gangliari, alcuni anomali ON-OFF, ma non pura risposte di tipo On-2. Usando il test VMR abbiamo dimostrato che il mutante NRC ha un normale OFF-risposta e un ritardato e lento ON-risposta (see Figura 5). Così, il mutante NRC non è completamente cieco come si pensava 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Figura 5" width="591" height="244" /> Figura 5: mutats NRC aumentare la loro attività in risposta ai cambiamenti di intensità di luce risposte comportamentali alla luce ON e OFF da WT e larve nrc mutanti a 5 dpf.. Ogni traccia rappresenta una media di 480 risposte da 120 singoli pesci di ogni genotipo. Il comportamento locomotorio media di mutanti NRC (tracce rosa) è leggermente ridotta rispetto al pesce WT (tracce blu) ma rimane vigorosa seguendo la luce OFF stimolo. Si noti il tempo lento aumento della risposta NRC mutante alla luce ON rispetto alla luce ON risposta del pesce WT.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

Le procedure sperimentali mostriamo nel film sono tutti rappresentativi di pesce WT. Tuttavia, questi esperimenti può essere fatto in modo analogo sul pesce mutante così (vedi risultato spaccato rappresentativo). Si consiglia di pesce piatto WT e pesce mutante nello stesso piatto in uno schema a scacchiera ai fini del controllo ottimale. Quando si utilizza pesce mutante nello stesso piatto di pesce WT assicurarsi di scrivere ciò che tipo di pesce è stato placcato in ciascun pozzetto. Ecco un suggerimento su come tenere traccia d...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

Il optocinetico riflesso (okr) è un semplice riflesso visivo esibito dalla maggior parte dei vertebrati e svolge un ruolo importante nello stabilizzare l&#39;occhio rispetto alla scena visiva. Tuttavia, il okr richiede che un animale rilevate delle righe in movimento ed è possibile che i pesci che non riescono a mostrare un okr non può essere completamente cieco. Uno zebrafish mutanti, il no optocinetica risposta c (NRC) non ha okr in qualsiasi condizione di luce testato e stato segnalato per essere completamente cieco. In precedenza, abbiamo dimostrato che OFF-ganglio attività delle cellule possono essere registrati in questi mutanti. Per determinare se il pesce mutante senza okr come il mutante in grado di rilevare incrementi nrc luce semplice e decrementa abbiamo sviluppato l&#39;analisi visiva motore comportamentale (VMR). In questo saggio, le larve di pesce zebra singoli sono posti in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti che consentono il controllo simultaneo di larve utilizzando un sistema automatico di video-tracking system. Le risposte locomotore di ogni larva a 30 minuti di luce ON OFF e 30 minuti di luce sono state registrate e quantificati. Pesce WT hanno un breve picco di attività motoria su luci accese, noto come riflesso di trasalimento, seguito dal ritorno inferiore alle attività di base, chiamato congelare. Pesce WT anche drasticamente aumentare la loro attività locomotoria subito dopo le luci spente e solo gradualmente (nell&#39;arco di diversi minuti) ritorno all&#39;attività di base locomotore. I mutanti NRC rispondono in modo simile alla luce OFF come pesci WT, ma mostrano una leggera riduzione della loro attività media rispetto al pesce WT. Attività motoria in risposta alla luce ON in NRC mutanti è in ritardo e lenta. C&#39;è un tempo di salita lenta della risposta nrc mutante alla luce ON rispetto alla luce WT ON risposta. I risultati indicano che i pesci NRC non sono completamente ciechi. Perché teleostei in grado di rilevare la luce attraverso la non-tessuti della retina, abbiamo confermato che le risposte immediate comportamentali alla luce intensità cambiamenti richiedono occhi intatti utilizzando la (chk) chokh mutanti, che mancano completamente gli occhi fin dai primi stadi dello sviluppo. Nel nostro test VMR, i mutanti chk mostrano alcun risposte di allarme a luce sia ON o OFF, mostrando che gli occhi laterali mediare questo comportamento. Il test VMR descritto qui integra la consolidata okr saggio, che non prova la capacità delle larve di zebrafish per rispondere ai cambiamenti di intensità di luce. Inoltre, l&#39;automazione del test VMR si presta a high-throughput screening per difetti di intensità luminosa guidato risposte visive.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Abbiamo sviluppato il Visual-Motor risposta per quantificare la potenza del motore di zebrafish larvale in risposta alla luce incrementi e decrementi. Abbiamo anche esaminato visione zebrafish mutanti, tra cui la non optocinetico risposta (NRC) mutanti, che si pensava essere completamente cieco quando testato da un altro saggio di visione, il riflesso optocinetica.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K Views.  Harvard. Abbiamo sviluppato il Visual-Motor risposta per quantificare la potenza del motore di zebrafish larvale in risposta alla luce incrementi e decrementi. Abbiamo anche esaminato visione zebrafish mutanti, tra cui la non optocinetico risposta (NRC) mutanti, che si pensava essere completamente cieco quando testato da un altro saggio di visione, il riflesso optocinetica.

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Ricerca

Biologia

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilazione Assay per studiare proteine ​​Arginina Metilazione

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

L&#39;utilizzo del Ramsay Assay misurare la secrezione di fluidi e Ion Flux Prezzi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Tubulo Malpighi

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...