Questo protocollo descrive un metodo facile ed economico per purificare le cellule staminali dal cervelletto postnatale. Queste cellule staminali rappresentano gli internauri a grana molecolare recentemente nati, ma rappresentano anche astrociti cerebellari di derivazione postnatal. Pertanto, lo studio di queste cellule è chiaramente importante per comprendere lo sviluppo del cervelletto.
Utilizzando questo protocollo, la resa delle cellule staminali è paragonabile a quella della strategia basata su FACS, che in genere è 10 volte più costosa. Questo protocollo può essere generalizzato per estrarre prominina-1 esprimendo cellule staminali da altri tessuti come intestino e midollo osseo. Inizia posizionando il piatto con il cervello al microscopio a dissezione.
Utilizzare le forcep bel numero cinque per rimuovere le meningi e i grandi vasi sanguigni dal cervelletto, quindi separare il cervelletto dal tronco encefalico usando la spatola. Trasferire il cervelletto in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione HBSS ghiacciata. Risciacquare quindi decantare l'HBSS.
Ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere cinque millilitri di soluzione di dissociazione tissutale a base di papaina che è stata pre-riscaldata a 37 gradi Celsius. Incubare il tessuto per 15 minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e mescolare lentamente il contenuto del tubo inverterlo da tre a cinque volte ogni tre minuti.
Preparare una pipetta Pasteur in vetro di grande diametro e di diametro stretto lucidando il fuoco su un bruciatore Bunsen. Dopo l'incubazione, lavare il tessuto tre volte con cinque millilitri di soluzione HBSS assicurandosi di evitare di perdere tessuto durante la decantazione. Dopo l'ultimo lavaggio HBSS, aggiungere cinque millilitri di DPBS con 250 microlitri di DNAsi al tessuto e dissociarlo triturando delicatamente da 10 a 15 volte con la pipetta Pasteur di grande diametro.
Quindi utilizzare la stretta pipetta Pasteur per triturare ulteriormente il liquame tissutale 10 volte. Se rimangono pezzi di tessuto più grandi, premerli contro il fondo del tubo con la punta della pipetta e continuare a pipettare fino a ottenere una sospensione fine. Posizionare i tubi della centrifuga sul ghiaccio.
Quindi sforzare le cellule dissociate attraverso un colino cellulare di 40 micrometri in un tubo da 50 millilitri. In cima al filtro con 10 millilitri di soluzione HBSS ghiacciata per garantire che le cellule passino attraverso la rete. Trasferire le celle filtrate in un tubo di centrifuga fresco da 15 millilitri e centrifugare la sospensione a 300 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi utilizzare un aspiratore di vuoto per rimuovere completamente il supernatante. Resuspend il pellet cellulare in 160 microlitri di tampone di colonna magnetica ghiacciata. Aggiungere 40 microlitri di microperline anti-prominin-1 alla sospensione cellulare.
Quindi incubare i tubi in frigorifero per 15 minuti per consentire all'anticorpo di legarsi alle cellule esprimenti prominin-1. Lavare le cellule con uno o due millilitri di tampone di colonna X e centrifugarle a 300 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di buffer di colonna X.Posizionare le colonne magnetiche sul supporto magnetico e sciacquarle una volta con 500 microlitri di tampone X.Applicare la sospensione cellulare etichettata sulla colonna e raccogliere il flusso in tubi freschi da 15 millilitri.
Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone X.Quindi rimuovere le colonne dal campo magnetico e posizionarle in tubi da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura e spingere lo stantuffo nella colonna per stanare le cellule taggate con perline prominin-1. Per passare le neurosfere, trasferirle insieme al mezzo di coltura in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri.
Pellettare le neurosfere per centrifugazione a 300 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Resuspend il pellet in cinque millilitri di mezzi di dissociazione con papaina o soluzione di tripside allo 0,05% e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare di nuovo la sospensione cellulare.
Quindi rimescolare le cellule in cinque millilitri di mezzo della neurosfera e dissociarle lentamente in pipettandole su e giù 10 volte con una pipetta Pasteur. Placcare le cellule nei mezzi della neurosfera come descritto nel protocollo di testo e arricchirle con neurosfere secondarie dopo sette o 10 giorni di coltura come descritto in precedenza. Contare le cellule su un emocitometro e placcare il numero ottimale di cellule su piastre rivestite in poli-D-lisina per esperimenti futuri.
Le cellule staminali cerebellari postnatali positive prominina-1 purificate dalla colonna formavano neurosfere nel mezzo della neurosfera ricco di fattore di crescita. Queste neurosfere erano positive per la prominina-1, il loro marcatore usato per l'isolamento e per altri marcatori di cellule staminali come la nednina e la GFAP. Cellule nel flusso attraverso il negativo macchiato per marcatori di cellule staminali prominina-1 e annidcina e positivo per marcatore neuronale beta-III tubulina.
Al ritiro dei fattori di crescita e in presenza di fattore inibitorio della leucemia o PDGF-AA, le neurosfere positive prominina-1 si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Quando si tenta questa tecnica, è importante assicurarsi che le neurosfere siano spinte attraverso per gli anticorpi prominin-1 e possano essere attraversate perché le cellule normali tendono anche a formare grumi che possono sembrare neurosfere. Usando questo metodo di isolamento, si possono caratterizzare i suoi lignaggi derivati come neuroni e glia in condizioni di salute e malattia.
Questo metodo è prezioso e fornisce una nuova visione del ruolo delle cellule staminali cerebellari nello sviluppo cerebellare e in condizioni di malattia come l'atassia spinocerebellare e il cancro.
